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蛋白纯化问题，希望大家给我支支招，成分感谢
我的蛋白70多KD，上清表达，表达量还可以，在C端加了6His标签，用生工的Ni柱填料挂柱纯化，洗脱后，洗脱液中无目的蛋白，只有杂蛋白，目的蛋白在流穿液当中，说明没挂上，（平衡缓冲液pH8.0，蛋白的等电点4.6左右，上样流速尝试过0.4和0.5ml/min），由于没挂上，打算用切非变性胶的方式纯化，来做后续实验，但将切下的胶电透浓缩后，跑SDS-PAGE分析，有很多杂带，目的条带的量也少，与杂带量差不多，在切的过程中，有时候还切不到自己的目的蛋白，怎么办呀，我已经就纯化蛋白这个问题做了很久了，还没啥进展，希望各位有经验的亲给我一些建议，谢谢谢谢........无数个谢谢。
你可以把你的蛋白做个50kd蛋白得超滤后，用8&&mol尿素变性，在过镍柱试试。
谢谢你的建议，不过换其他tag，我的需要从合成引物开始，因为之前由于考虑到其他实验，所以我引物的酶切位点和其他载体不兼容，所以这个方法可能留在最后尝试了
左边是Marker,中间是空载，右边粗的那条带是表达的蛋白，从图上看说明是表达了的，挂柱的图当时由于想着没挂上，就忘拍了，所以图就不能上传了
你说的那个NaCl&&可能我没表达清楚哈
蛋白有盐溶盐析作用，一定浓度的NaCl可以增加蛋白的可溶度，减少蛋白与蛋白之间的非特异性相互作用，只有浓度很高的时候才会促使蛋白沉淀
如果Tris应该只有盐酸调PH，你说盐酸和NaCl调ph没看太懂，一般过镍柱加300~500mM NaCl比较合适
如果解决不了，看你实验室配置吧 不行就用离子交换先纯化下，然后过个分子筛看你蛋白natural 状态下分子量是多少就知道有没有聚合了
关于你说的非变性胶电透回收，想了解下，跑sds-page你蛋白时你蛋白是没有了 还是变成其它的小分子量的蛋白了呢？
nemo88同学说的有道理，楼主可以参考一下。
首先，用histag蛋白阳性对照确认你的ni柱work。
然后，在buffer中添加变性剂如尿素（可先试一下高浓度尿素以确认确实work），打开蛋白质内部可能包裹的histag。（注：如果histag被包裹在蛋白立体结构内部而无法与ni接触，尿素可以破坏氢键从而暴露内部结构）
最后，还不行的话，用histag抗体做个western，看看你SDS-PAGE胶上的条带中是否存在带histag的蛋白。
祝你好运！
我打错了，是用HCl调，不小心加多了，就用NaoH调，跑SDS-PAGE之后有我的目的蛋白，也有6条其他小分子量的杂蛋白
谢谢，但有一个问题，就是我想获得的蛋白尽量维持天然的结构，用尿素变性之后还能复性到原来的结构吗
额& &为嘛用氢氧化钠？调过了？^_^
有么有试过电透回收后的蛋白放几天再制备次样品，跑个sds-page同时点上前几天的样品做对照& &看看目的蛋白有没有变少、、、
呵呵，是调过了，没有试过放几天再跑，因为回收后的蛋白量很少，放几天的话，很可能降解得看不到了，所以没做
所以你觉着你的蛋白会降解了？那最好还是确定过柱时是否发生了降解，掉了histag
我重新挂了一次柱，改变了一样上样方法，就是把样和填料结合了8个小时，再放出来，再用流穿液继续上样，但出现很奇怪的结果，左边是上样前（粗的那条是目的条带），中间是流穿液第1次和第2次的，最右边直接用500mM咪唑洗脱的，洗脱液中，目的条带上面居然多出一条带，我用的填料是新的，一次也没用过。
离子交换我们实验室都没做过，所以不知道怎么做
N端和C端都有功能区，C端离功能区远点，所以在C端设计的，弱弱地问一句，怎么在His之前加6个Gly，用的histag是载体本身自带的
依次点突变环P,很快就OK了。
或者看在引物里面加对应密码子
这个方法感觉好高大上啊，我不会做，我们实验室有做点突变的，但往往突变的都不是自己希望突变的那个，所以这个依次点突变对我而已无从下手，咋做的哟？但也很感谢你给我的建议
有his标签的蛋白不一定亲和就能成功，可能与蛋白本身有关。离交换很好操作，你的蛋白等电点4点几，溶液ph为8，那么此时蛋白带负电荷，选择阴离子交换，目标蛋白结合在填料上，用高盐进行洗脱。具体操作可以参GE公司的离子交换操作手册。如果你没有我可以发给你。
看来是确实不挂柱子，要想找原因，一个是确定基因序列没有移码确定表达成了his还是表达成了别的氨基酸，另一个就是westrn检测histag是否还在
或者就像前面朋友说的多加点尿素，直接变性，先不用担心复性的问题，先把这个问题解决，复性是有方法的只是可能要摸索下
咪唑直接洗脱多了一条带这个也不好说是多出来的，因为亲和柱属于富集型的柱子，举个栗子，有个蛋白浓度比较低，在你样品中量被稀释了跑电泳可能看不清，但是全部挂到柱子上，那洗脱的时候就相当于被浓缩到你的洗脱液里面，跑电泳就可能看出来了&&这也是有可能的
这个是我以前做的&&左1是破碎完样品 左二离心过滤后样品&&左三流穿 然后是洗脱的&&想说明有些条带变浓是正常的&&
如果被这个问题整的烦，有离子交换的 可以尝试离子交换
从引物上面加
:DMarker跑的很漂亮，赞一个。
谢谢您的回复，目前我的问题已经解决了，谢谢大家的关注
没事 解决就好啦~
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【求助】蛋白加loading buffer煮后有沉淀，电泳条带弯曲，样品中300mM NaCl，算不算高盐？
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这个帖子发布于2年零131天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
同上，提的胰腺组织蛋白，按说明书用的2*细胞裂解液（NaCl浓度300mM），提的蛋白浓度很高。蛋白+裂解液稀释+5*loading buffer煮沸5min后，有少量不溶颗粒样物存在，而且-80度冻存后再取出跑电泳时，不溶颗粒更加明显，离心能离下去好多，电泳跑出的条带不是波浪形就是断断续续，有时还跑不出来，marker跑的很好，想来应该不是胶的问题。想请教一下是不是样品盐离子高的原因？因为我的胰岛细胞用1*细胞裂解液（NaCl浓度150mM）提蛋白就没有这种现象，条带很清晰。实在困惑，做了1个多月western也没什么结果，着实着急。请各位前辈不吝赐教！万分感激！
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开始提取蛋白煮之前不就应该离心取上清液，怎么煮过之后又会有沉淀？
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蛋白浓度稀释到8ug/ul以下。不解释。
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wenshl2005 蛋白浓度稀释到8ug/ul以下。不解释。请问，我的目的蛋白表达量很低，提出来的总蛋白大于30mg/ml，但是目的条带仍然很低！这种情况怎么办？之前出现的问题是条带连成一条线，后来只好隔孔加样，稀释蛋白后会好些，可是目的就惨淡了，请问战友有什么好的建议吗，不胜感激！
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上样时样品中的SDS必须完全溶解 样品用振子混匀
不然每次趋势都不一样
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这个的确是个问题呀。稀释之后浓度下降对于表达量不高的蛋白比较难检出。
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蛋白总量浓度过大加loadingbuffer是会沉淀，你的盐浓度不高，不知道你实验目的是啥，看能不能做个co-ip，如果不想稀释的话。
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怎么根据蛋白量加lodding buffer
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我们实验室是根据蛋白浓度（BCA法测量）算好蛋白质的上样量，然后加SDS loading buffer 补充成30uL即可。
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先用BCA法测定蛋白浓度，根据浓度算出上样量，根据上样量的四分之一，加入5*的loading buffer
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我们这边也是用bca测蛋白哦浓度的，然后根据浓度算出上样量，一般是所有上样量中最大的上样量除以几成的buffer，比如上样量是18，buffer是六成的，那就加3微升的buffer
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loading buffer都是根据上样体积确定添加量的，最终电泳时的样品中保证SDS-loading buffer浓度是1x的即可
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JacquelineLiu 先用BCA法测定蛋白浓度，根据浓度算出上样量，根据上样量的四分之一，加入5*的loading buffer谢谢
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【求助】western blot 蛋白可以在加loading buffer之前煮吗？
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这个帖子发布于7年零91天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
western blot 蛋白可以在加裂解液后，未加loading buffer之前煮吗？这样的样品还能用吗？
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碧峤 edited on
碧峤 western blot 蛋白可以在加裂解液后，未加loading buffer之前煮吗？这样的样品还能用吗？我不知道你是想研究变性蛋白还是非变性的，如果研究变性的，加完裂解液后是可以煮的，是为了使蛋白充分变性，而不破坏蛋白的结构；若是研究非变性的蛋白，就不能煮了！
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未加loading buffer之前煮,多数蛋白都会沉淀变性。再加loading buffer可能存在溶解不完全的情况，理论上对电泳结果还是有影响的。
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