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Western blot内参问题
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生物医学专家|
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【求助/交流】western blot的内参总是不齐怎么办
我做的是动物组织蛋白，定量时定的0.997，变性的时候盖子也盖紧了的，上样的时候也没有漏样，可是显影得到的β-actin就是不齐，就是不知道哪里出问题了，很郁闷啊，β-actin一眼就看出来不齐，我很悲伤。:tuzi3:
换一批就好了？不会吧，那这批的怎么办呢？
:tuzi3:谢谢
确实很磨人，但是师兄师姐做的时候，我觉得他们都做的很好啊
染色只看上面的还很均匀，但是下面一点就不是了，师兄说可能是取的肝的部位不同，我也不知道是不是
这个确实变性的时候存在这个问题，谢谢，下次我按你的方法做。那个降解的倒是不打可能，因为我是定量了立马就做了。
运气？不会吧，做的好的人还是做的好的
最近我们组的片子背景很黑& &系统重新换了的原因& &没找好最佳状态
新的抗体？
为什么要重新换系统，
原来的做的好，为什么不用原来的
不太明白前面几位答的什么...可能我是新手的缘故吧...
β-actin不齐，你电泳时的分层胶是哪个公司的？还是自己做的？
如果是自己做的，好好练习做胶
如果是买的，你电泳的电压和时间分别是多少？
不齐的话，电压小点，跑的时间长点.
:tuzi11::tuzi32:
原来的带浅& & 抗体太浪费了
不是说跑的前后不一致，是说最后得到的蛋白量不一样
是饿哦自己手法问题吧
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【求助】western blot 参数蛋白不齐
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这个帖子发布于2年零173天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
为什么western blot
用BCA测蛋白浓度
可是做出的 B-actin 参数蛋白都不齐
有的明显很少
可是上样是精细算过的呀
不知道邀请谁？试试他们
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帮顶一个，也遇到过这样的问题。见到有大神说BCA根本不准，因为没有考虑到蛋白自身结构的对浓度的影响，直接自己根据细胞生长情况少量多试几次摸索上样量的。
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大神你说的那个：“因为没有考虑到蛋白自身结构的对浓度的影响”什么意思啊？然后我这个内参一多一少会是怎么一回事啊？
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BCA测的时候很容易出问题， 误差也大。
所以一般只测个大概，上样后再根据内参的强度稍稍微调一下。不过好像一般也没你这么明显的差异另外不知道你用的是哪个内参，像actin在某些样品中容易降解，这个也需要考虑一下。
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丁香园准中级站友
唉，我的内参也总跑不齐，而且差异也很大，我BCA定量已经很小心了，而且我的标准曲线R方都在0.99以上，孔间差异也很小，真是很郁闷啊
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跑不齐的，建议选好做一点的内参，GAPDH什么 的特别好做。测浓度测不准看来是个大问题， 倒不是说你R方越大就一定越准，而是干扰物质会影响你的结果。
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tomluoshen
大神你说的那个：“因为没有考虑到蛋白自身结构的对浓度的影响”什么意思啊？然后我这个内参一多一少会是怎么一回事啊？看你跑胶感觉洗膜不是很干净的样子，你再检查一下制胶的过程中，胶里有没有气泡，或者转膜的时候是不是把气泡都赶尽了，如果上样没问题的话。当然，孵育一抗二抗是否能够全部覆盖也会有关系。现在wb做得多了，感觉BCA侧蛋白浓度已经问题不是那么关键了，呵呵
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