问： 10 机核网每期节目开头bgm是什么，就是那个“welcome to the futuridium ep deluxe
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时间：2016-01-20 08:39
SMALL-MOLECULE-POLYPEPTIDE CONJUGATE FOR INHIBITING HIV INFECTION
WIPO Patent Application WO/
Disclosed is anti-HIV infection polypeptide. The present invention relates to polypeptide expressed in formula I, derivative thereof, stereisomer thereof, or salt thereof with no physiological toxicity. Also disclosed are a pharmaceutical composition containing the polypeptide in formula I, the derivative thereof, the stereisomer thereof, or the salt thereof with no physiological toxicity, and use of the polypeptide in formula I, the derivative thereof, the stereisomer thereof, or the salt thereof with no physiological toxicity in treating or preventing related diseases caused by HIV infection, especially acquired immunodeficiency syndrome (AIDS).
Inventors:
LIU, Keliang (No.27, Taiping Road Haidian District, Beijing 0, 100850, CN)
WANG, Chao (No.27, Taiping Road Haidian District, Beijing 0, 100850, CN)
SHI, Weiguo (No.27, Taiping Road Haidian District, Beijing 0, 100850, CN)
CAI, Lifeng (No.27, Taiping Road Haidian District, Beijing 0, 100850, CN)
WANG, Kun (No.27, Taiping Road Haidian District, Beijing 0, 100850, CN)
FENG, Siliang (No.27, Taiping Road Haidian District, Beijing 0, 100850, CN)
HAN, Han (No.27, Taiping Road Haidian District, Beijing 0, 100850, CN)
Application Number:
Publication Date:
12/19/2013
Filing Date:
06/08/2013
Export Citation:
INSTITUTE OF PHARMACOLOGY AND TOXICOLOGY ACADEMY OF MILITARY MEDICAL SCIENCES P.L.A. CHINA (No.27, Taiping Road Haidian District, Beijing 0, 100850, CN)
International Classes:
C07K14/16; A61K38/16; A61P31/18
View Patent Images:
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Domestic Patent References:
Foreign References:
Other References:
ZHAO LEI ET AL.: 'A multi-functional peptide as an HIV- entry inhibitor based on self-concentration, recognition, and covalent attachment' ORGANIC & BIOMOLECULAR CHEMISTRY vol. 10, August 2012, pages 6512 - 6520
Attorney, Agent or Firm:
CCPIT PATENT AND TRADEMARK LAW OFFICE (8th Floor, Vantone New World Plaza2 Fuchengmenwai Street, Xicheng District, Beijing 7, 100037, CN)
权 利 要 求
1. 式 I所示的化合物、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生理毒 性的盐，
Sm - Li - A - L2 - Choi 式 I 其中，
Sm为小分子化合物， 例如能够与 HIV-1 gp41 N-trimer表面疏水 性口袋区特异性结合的小分子化合物； 或者 Sm缺失；
为连接多肽 A与 Sm间的连接臂， 例如为使得 Sm能够保持空 间灵活性而与靶标即 HIV-1 gp41 N-trimer表面疏水性口袋区结合的 连接多肽 A与小分子间的连接臂； 或者 缺失；
多肽 A的 ^^^列为 INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 或者 NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
为连接多肽 A与胆固醇分子间的连接臂；
Choi为胆固醇。
2. 根据权利要求 1所述的化合物、 其衍生物、 其立体异构体、 或 其无生理毒性的盐，
Sm选自如下小分子化合物：
3. 根据权利要求 1或 2所述的化合物、其衍生物、其立体异构体、 或其无生理毒性的盐，
其中， ^和^独立地选自天然或非天然氨基酸、 二酸、 二胺、 二 醇， 以及一端为氨基或者一端为羧基的聚乙二醇。
4. 根据权利要求 1至 3中任一项所述的化合物、 其衍生物、 其立 体异构体、 或其无生理毒性的盐，
其中， ^和^独立地选自：
L型或 D型的： 甘氨酸（Gly) ， 丙氨酸 (Ala), 亮氨酸（Leu) , 异亮氨酸 (He), 谷氨酸（Glu) ,谷酰胺（Gin) ,天冬氨酸（Asp) ， 天冬酰胺（Asn) , 缬氨酸（Val) ,赖氨酸 (Lys), 丝氨酸（Ser) , 苏 氨酸（Thr ) ,精氨酸（ Arg ) , 组氨酸（His ) , 色氨酸（ Trp ) , 苯丙 氨酸（Phe ) , 酪氨酸（Tyr ) , 半胱氨酸（ Cys )、 甲硫氨酸（Met )；
Y - J ^丁酸（GABA )
6- J ^己酸 (Aca);
乙二酸、 丙二酸、 丁二酸、 戊二酸、 己二酸；
乙二胺、 丙二胺、 丁二胺、 戊二胺、 己二胺；
乙二醇、 丙二醇、 丁二醇、 戊二醇、 己二醇；
NH2-CH2CH2-0-CH2CH2-COOH(PEG1);
NH2-CH2CH2-0-CH2CH2-0-CH2CH2 COOH(PEG2); 和 NH2-CH2CH2-0-CH2CH2-0-CH2CH2-0-CH2CH2-COOH(PEG3)。
5.根据权利要求 1所述的式 I化合物、其衍生物、其立体异构体、 或其无生理毒性的盐， 其中， 所述式 I化合物选自如下的化合物： HT NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
HT- β Ala- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
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NB2L - β Ala- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
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NB2L -PEG2- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
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NB2L - β Ala- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
NB2L -Aca-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL; NB2L -2Aca-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
NB2L -PEGi- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL；
NB2L -PEG2- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL；
NB2L -PEG3- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL；
NB2L -INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C
NB2L- β Ala-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β Ala-C-C NB2L-Aca--INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β Ala-C-C NB2L-2Aca-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β Ala-C-C NB2L-PEG!-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β Ala-C-C NB2L-PEG2-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β Ala-C-C 和
NB2L-PEG3-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β Ala-C-Chol。
6. 一种药物组合物，其含有至少一种权利要求 1至 5中任一项所 述的式 I化合物、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生理毒性的盐； 可选地， 其还包含药学上可接受的载体或辅料； 具体地， 所述药物组 合物为 HIV融合抑制剂。
7. 权利要求 1至 5中任一项所述的式 I化合物、 其衍生物、 其立 体异构体、 或其无生理毒性的盐或者权利要求 6所述的药物组合物在 制备抑制 HIV融合的药物或者试剂例如 HIV融合抑制剂中的用途。
8. 权利要求 1至 5中任一项所述的式 I化合物、 其衍生物、 其立 体异构体、 或其无生理毒性的盐或者权利要求 6所述的药物组合物在 制备用于治疗和 /或预防和 /或辅助治疗 HIV感染相关疾病特别是艾滋 病的药物中的用途。
9. 一种在体内或体外抑制 HIV融合的方法， 包括使用有效量的 权利要求 1至 5中任一项所述的式 I化合物、 其衍生物、 其立体异构 体、 或其无生理毒性的盐或者权利要求 6所述的药物组合物的步骤。
10.一种治疗和 /或预防和 /或辅助治疗 HIV感染相关疾病特别是艾 滋病的方法， 包括使用有效量的权利要求 1至 5中任一项所述的式 I 化合物、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生理毒性的盐或者权利要 求 6所述的药物组合物的步骤。
Description:
抑制 HIV感染的小分子 -多肽缀合物 技术领域
本发明属于医药化工领域， 涉及一种抑制 HIV感染的小分子与多 肽缀合物。 具体地， 本发明涉及式 I所示的化合物 （缀合物） 、 其衍 生物、 其立体异构体、 或其无生理毒性的盐。 本发明还涉及含有上述 的式 I化合物、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生理毒性的盐的药 物组合物， 以及式 I化合物、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生理 毒性的盐在制备治疗和 /或预防和 /或辅助治疗 HIV感染所致相关疾病 尤其是获得性免疫缺陷综合征 ( AIDS, 即艾滋病） 的药物中的用途。
Sm - Li - A - L2 - Choi 式 I 。
艾滋病主要是由于人免疫缺陷病毒 I型 （HIV-1 )感染导致的致 死性传染疾病， 在全球范围流行。 目前临床上应用的抗 HIV-1药物， 辅以高效抗逆转录病毒疗法，可以在一定程度上延长 HIV感染者的生 存时间和改善其生活质量。 但是， 由于 HIV疫苗研究进展緩慢以及耐 药性问题日益明显， 研发新型抗 HIV药物仍是当务之急。
Gp41是介导 HIV-1与靶细胞膜融合的特异性蛋白， 是融合抑制剂 的作用靶标。 Gp41 的胞外区存在着两个与膜融合密切相关的螺旋结构 功能区， 即 N末端重复序列 （HR1 )和 C末端重复序列 （HR2 ) 。 在 膜融合过程中， HR2 与 HR1 相互作用， 形成一个六螺旋体核心结构 ( 6-HB ) 。
HIV融合抑制剂 （ HIV fusion inhibitors )是干扰病毒进入靶细胞 的新型抗 HIV药物， 其在感染的初始环节切断病毒的传播， 这对于预 防及控制 HIV-1感染具有特殊意义，因而成为新机制抗 HIV药物研究 的热点。
T20是衍生于 gp41 HR2区域的具有 36个氨基酸残基的融合抑制 多肽， 于 2003年经美国 FDA批准上市， 是目前唯一上市的 HIV-1融 合抑制剂。 T20能竟争性的和 HR1构成的螺旋三聚体结合， 占据 HR2 的作用位点， 进而抑制 6-HB的形成， 使得膜融合过程不能完成。
T20的上市开辟了多肽类药物控制 HIV-1的新领域。 但是， T20 本身存在着一些缺陷和不足。 首先是耐药性问题： 由于 T20完全衍生 于天然 HR2 序列， 对靶标突变的抵抗力低， 容易产生耐药性。 HR1 第 36-45位残基 ( GIVQQQNNLL, SEQ ID NO: 5 )是 T20结合的主 要部位， 单个残基的突变导致 T20敏感度下降 5 - 10倍， 两个残基突 变则会导致敏感度下降 100倍。 其次， T20体内稳定性差， 易被蛋白 酶降解， 生物利用度低。 再次， T20 具有较高的合成成本。 因此， 在 保证生物活性的前提下如何解决耐药性、 提高酶解稳定性以及降低多 肽类 HIV-1 融合抑制剂的合成成本是新型 HIV-1 融合抑制剂研究的 主要方向。
基于上述问题，目前主要的解决策略是避开 T20的靶标结合部位， 引入不同于 T20的新的功能序列来克服耐药性； 同时， 加入螺旋形成 及稳定因子， 提高序列的螺旋性及稳定性， 提高酶解稳定性及抑制活 性。如第二代多肽类融合抑制剂 T-1249, 在其 N端增加了与 N-trimer 疏水性口袋结合序列 （WQEWEQKI, SEQ ID NO: 6 )， 使其活性比 T20提高了一个数量级； 又如第三代融合抑制剂 T-1144, 和 T20的靶 标作用位点完全不同， 主要为 HR1 的疏水性口袋区 (WEAWERAI, SEQ ID NO: 7),, I期临床研究结果表明， T-1144能够显著抑制 T20 耐药性毒林，同时比 T20显示了更高的活性及更好的药代动力学性质。 此外， 5HR系列多肽开创了基于靶标 gp41 HR1螺旋三聚体的三维晶 体结构应用计算机辅助设计完全非天然 α螺旋肽的新思路。以 5HR为 先导结构，在其 Ν端引入口袋结合区（ WMEWDRE, SEQ ID NO: 8 )， C端引入脂膜结合区 （WASLWNWF, SEQ ID NO: 9 ) ,使得抑制融 合活性得到了显著提高。
Gp41 N-trimer表面的疏水性口袋同时是小分子融合抑制剂的作 用靶点。 如 NB-2, 其 EC5。值达到 1.04 μ Μ; Α12同样在 尔水平显 示了抑制 HIV复制活性， EC5。值为 0.69 μ Μ; 从橄榄叶中提取的天然 小分子化合物羟基酪醇（hydroxytyrosol, HT )抑制 HIV复制活性达 到 50 μ Μ。 但是， 小分子融合抑制剂活性远不及肽类融合抑制剂。 其原 因在于： （1 )单独的小分子只是部分占据了疏水口袋， 与靶标结合力 低， 不足以竟争性抑制 6-ΗΒ形成； （ 2 )单独的小分子识别能力不强， 靶点附近的局部浓度不高。
目前， 尚需要新的有效抑制 HIV的化合物。 发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动， 得到了一类化合物， 并且本发明人惊奇地发现， 该化合物能够有效地抑制 HIV融合。 由此 提供了下述 明： 本发明的一个方面涉及式 I所示的化合物（小分子-多肽缀合物）、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生理毒性的盐，
Sm - Li - A - L2 - Choi 式 I 其中，
Sm为小分子化合物， 例如能够与 HIV-1 gp41 N-trimer表面疏水 性口袋区特异性结合的小分子化合物； 或者 Sm缺失；
为连接多肽 A与 Sm间的连接臂， 例如为使得 Sm能够保持空 间灵活性而与靶标即 HIV-1 gp41 N-trimer表面疏水性口袋区结合的 连接多肽 A与小分子间的连接臂； 或者 缺失；
多肽 A的 ^^^列为 INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL ( SEQ ID NO: 1 )或者 NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL ( SEQ ID NO: 2 ) ；
L2为连接多肽 A与胆固醇分子间的连接臂；
Choi为胆固醇。
根据本发明任一项所述的化合物、 其衍生物、 其立体异构体、 或 其无生理毒性的盐， 其中，
Sm选自如下小分子化合物:
不拘于理论的限制， NB-2-L及 M-A12分别是在 NB-2及 A12分 子的吡咯环 3位引入一个 ^^作为与多肽 A连接的 Linker (连 )； M-NB2及 A12-L分别是在 NB-2及 A12分子的盼羟基上引入羧甲基作 为 Linker (连接臂） ， 使其与多肽 A相连。 上面的小分子化合物均为现有技术中已知的化合物。 ！！！^至 HT8 均为可购买的化合物， HT的合成可以参考实施例 1。
多肽合成也是本领域人员熟知的技术,小分子化合物可以作为最 后的残基与多肽 N端氨基缩合； 缀合物裂解后纯化； C端接有胆固醇 的缀合物需将 C端引入半胱氨酸的中间体纯化后与溴代胆固醇反应， 再次分离纯化。
不拘于理论的限制， 单独的肽类药效团和单独的小分子均显示较 低的融合抑制活性， 本发明人创造性地将衍生于 gp41 HR2的肽类药 效团与非肽类药效团缀合， 特别是在非肽类药效团中选 ^当的位置 引入连接臂， 不破坏原来的活性， 而且使两者发挥协同作用， 设计全 新结构 HIV融合抑制剂， 探索抑制耐药性、 提高肽类药物稳定性及降 低肽合成成本
根据本发明任一项所述的化合物、 其衍生物、 其立体异构体、 或 其无生理毒性的盐，
其中， ^和^独立地选自天然或非天然氨基酸、 二酸、 二胺、 二 醇， 以及一端为氨基或者一端为羧基的聚乙二醇。
根据本发明任一项所述的化合物、 其衍生物、 其立体异构体、 或 其无生理毒性的盐，
其中， ^和^独立地选自：
L型或 D型的： 甘氨酸（Gly) ， 丙氨酸 (Ala), 亮氨酸（Leu) , 异亮氨酸 (He), 谷氨酸（Glu) ,谷酰胺（Gin) ,天冬氨酸（Asp) ， 天冬酰胺（Asn) , 缬氨酸（Val) ,赖氨酸 (Lys), 丝氨酸（Ser) , 苏 氨酸（Thr) ,精氨酸（ Arg) ,组氨酸（His) , 色氨酸（ Trp ) ,苯丙 氨酸（Phe) ,酪氨酸（Tyr) ,半胱氨酸（ Cys )、 甲硫氨酸（Met)；
Y- J ^丁酸（GABA)
6- J ^己酸 (Aca);
乙二酸、 丙二酸、 丁二酸、 戊二酸、 己二酸；
乙二胺、 丙二胺、 丁二胺、 戊二胺、 己二胺； 乙二醇、 丙二醇、 丁二醇、 戊二醇、 己二醇；
NH2-CH2CH2-0-CH2CH2-COOH(PEG1);
NH2-CH2CH2-0-CH2CH2-0-CH2CH2 COOH(PEG2); 和
NH2-CH2CH2-0-CH2CH2-0-CH2CH2-0-CH2CH2-COOH(PEG3)。 根据本发明任一项所述的式 I化合物、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生理毒性的盐， 其中， 所述式 I化合物选自如下的化合物： 1 HT NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
2 HT- β Ala- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
3 HT—Aca— NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
4 HT-2Aca-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL；
5 HT--PEGi-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
6 HT--PEG2-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
7 HT--PEG3-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
8 NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C
9 HT-NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C
10 HT- β Ala- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
11 HT—Aca— NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
12 HT-2Aca-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
13 HT--PEGi-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
14 HT--PEG2-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
15 HT--PEG3-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
16 HT INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
17 HT- β Ala- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL; HT—Aca— INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
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A12L -2Aca-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
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A12L --PEG2-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
A12L --PEG3-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
A12L -INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C 81 A12L- β Ala-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β Ala-C-C
82 A12L--Aca--INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
83 A12L-2Aca--INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
84 A12L -PEd-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
85 A12L--PEG2-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
86 A12L--PEG3-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
87 MA12 NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
88 MA12- β Ala- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL；
89 MA12--Aca-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL；
90 MA12-2Aca-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
91 MA12--PEG!-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
92 MAI2--PEG2-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
93 MAI2--PEG3-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
94 MA12-NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C 95 MA12- β Ala- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
96 MA12--Aca-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
97 MA12-2Aca-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
98 MA12--PEG!--NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
99 MAI2--PEG2--NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β Ala-C-C
100 MAI2--PEG3-NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
101 MA12 INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL；
102 MA12- β Ala- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL；
103 MA12--Aca-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL；
104 MA12-2Aca-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
105 MA12--PEG!-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
106 MAI2--PEG2-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
107 MAI2--PEG3-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
108 MA12-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C 109 MA12- β Ala-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
110 MA12-Aca-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
111 MA12-2Aca-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
112 MAH-PEd-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
113 MAI2-PEG2-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
114 MAI2-PEG3-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
115 NB2L NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL；
116 NB2L - β Ala- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
117 NB2L -Aca-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
118 NB2L -2Aca- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
119 NB2L -PEGi- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
120 NB2L -PEG2- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL; 121 NB2L -PEG3- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
122 NB2L -NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C 123 NB2L- β Ala- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
124 NB2L-Aca-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
125 NB2L-2Aca-NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
126 NB2L-PEG!--NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
127 NB2L-PEG2--NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
128 NB2L-PEG3-NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
129 NB2L INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
130 NB2L - β Ala- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
131 NB2L -Aca-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
132 NB2L -2Aca- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL；
133 NB2L -PEGi- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL；
134 NB2L -PEG2- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL；
135 NB2L -PEG3- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL；
136 NB2L -INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C 137 NB2L- β Ala-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
138 NB2L-Aca--INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
139 NB2L-2Aca-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
140 NB2L-PEG!-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β Ala-C-C
141 NB2L-PEG2-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
Ala-C-C 和
142 NB2L-PEG3-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
Ala-C-Chol。 本发明的另一方面涉及一种药物组合物， 其含有至少一种本发明 任一项所述的式 I化合物、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生理毒 性的盐； 可选地， 其还包含药学上可接受的载体或辅料； 具体地， 所 述药物组合物为 HIV融合抑制剂。
通常本发明药物组合物含有 0.1 - 90重量％的式 I化合物和 /或其 生理上可接受的盐。 药物组合物可根据本领域已知的方法制备。 用于 此目的时， 如果需要， 可将式 I化合物和 /或立体异构体与一种或多种 固体或液体药物赋形剂和 /或辅剂结合， 制成可作为人用的适当的施用 形式或剂量形式。
本发明的式 I化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给 药， 给药途径可为肠道或非肠道， 如口服、 肌肉、 皮下、 鼻腔、 口腔 粘膜、 皮肤、 腹膜或直肠等。 给药剂型例如片剂、 胶囊、 滴丸、 气雾 剂、 丸剂、 粉剂、 溶液剂、 混悬剂、 乳剂、 颗粒剂、 脂质体、 透皮剂、 口含片、 栓剂、 冻干粉针剂等。 可以是普通制剂、 緩释制剂、 控释制 剂及各种微粒给药系统。 为了将单位给药剂型制成片剂， 可以广泛使 用本领域公知的各种载体。 关于载体的例子是， 例如稀释剂与吸收剂， 如淀粉、 糊精、 硫酸钙、 乳糖、 甘露醇、 蔗糖、 氯化钠、 葡萄糖、 尿 素、 碳酸钙、 白陶土、 微晶纤维素、 硅酸铝等； 湿润剂与粘合剂， 如 水、 甘油、 聚乙二醇、 乙醇、 丙醇、 淀粉浆、 糊精、 糖浆、 蜂蜜、 葡 萄糖溶液、 阿拉伯胶浆、 明胶浆、 羧甲基纤维素钠、 紫胶、 甲基纤维 素、 磷酸钾、 聚乙烯吡咯烷酮等； 崩解剂， 例如干燥淀粉、 海藻酸盐、 琼脂粉、 褐藻淀粉、 碳酸氢钠与枸橼酸、 碳酸钙、 聚氧乙烯、 山梨糖 醇脂肪酸酯、 十二烷基磺酸钠、 甲基纤维素、 乙基纤维素等； 崩解抑 制剂， 例如蔗糖、 三硬脂酸甘油酯、 可可脂、 氢化油等； 吸收促进剂， 例如季铵盐、 十二烷基硫酸钠等； 润滑剂， 例如滑石粉、 二氧化硅、 玉米淀粉、 硬脂酸盐、 硼酸、 液体石蜡、 聚乙二醇等。 还可以将片剂 进一步制成包衣片， 例如糖包衣片、 薄膜包衣片、 肠溶包衣片， 或双 层片和多层片。 为了将给药单元制成丸剂， 可以广泛使用本领域公知 的各种载体。 关于载体的例子是， 例如稀幹剂与吸收剂， 如葡萄糖、 乳糖、 淀粉、 可可脂、 氢化植物油、 聚乙烯吡咯烷酮、 Gelucire、 高岭 土、 滑石粉等； 粘合剂如阿拉伯胶、 黄蓍胶、 明胶、 乙醇、 蜂蜜、 液 糖、 米糊或面糊等； 崩解剂， 如琼脂粉、 干燥淀粉、 海藻酸盐、 十二 烷基磺酸钠、 甲基纤维素、 乙基纤维素等。 为了将给药单元制成栓剂， 可以广泛使用本领域公知的各种载体。 关于载体的例子是， 例如聚乙 二醇、 卵磷脂、 可可脂、 高级醇、 高级醇的酯、 明胶、 半合成甘油酯 等。 为了将给药单元制成胶囊， 将有效成分式 I化合物或其立体异构 体与上述的各种载体混合， 并将由此得到的混合物置于硬的明明胶囊 或软胶囊中。也可将有效成分式 I化合物或其立体异构体制成微囊剂， 混悬于水性介盾中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。 为了将给药单元制成注射用制剂， 如溶液剂、 乳剂、 冻干粉针剂和混 悬剂， 可以使用本领域常用的所有稀幹剂， 例如， 水、 乙醇、 聚乙二 醇、 1,3-丙二醇、 乙氧基化的异硬脂醇、 多氧化的异硬脂醇、 聚氧乙烯 山梨醇脂肪酸酯等。 另外， 为了制备等渗注射液， 可以向注射用制剂 中添加适量的氯化钠、 葡萄糖或甘油， 此外， 还可以添加常规的助溶 剂、 緩冲剂、 pH调节剂等。
此外， 如需要， 也可以向药物制剂中添加着色剂、 防腐剂、 香料、 矫味剂、 甜味 剂或其它材料。
本发明式 I化合物， 或其异构体的给药剂量取决于许多因素， 例 如所要预防或治疗疾病的性盾和严重程度， 患者或动物的性别、年龄、 体重及个体反应， 所用的具体化合物， 给药途径及给药次数等。 上述 剂量可以单一剂量形式或分成几个， 例如二、三或四个剂量形式给药。
本文所用的术语 "组合物" 意指包括包含指定量的各指定成分的 产品，以及直接或间接从指定量的各指定成分的组合产生的任何产品。 可改变本发明药物组合物中各活性成分的实际剂量水平， 以便所 得的活性化合物量能有效针对具体患者、 组合物和给药方式得到所需 的治疗反应。 剂量水平须根据具体化合物的活性、 给药途径、 所治疗 病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。 但是， 本 领域的做法是， 化合物的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水 平开始， 逐渐增加剂量， 直到得到所需的效果。 本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的式 I化合物、 其衍生 物、 其立体异构体、 或其无生理毒性的盐或者本发明的药物组合物在 制备抑制 HIV融合的药物或者试剂例如 HIV融合抑制剂中的用途。
本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的式 I化合物、 其衍生 物、 其立体异构体、 或其无生理毒性的盐或者本发明的药物组合物在 制备用于治疗和 /或预防和 /或辅助治疗 HIV感染相关疾病特别是艾滋 病的药物中的用途。 本发明的再一方面涉及一种在体内或体外抑制 HIV融合的方法， 包括使用有效量的本发明任一项所述的式 I化合物、 其衍生物、 其立 体异构体、 或其无生理毒性的盐或者本发明的药物组合物的步骤。
本发明的再一方面涉及一种治疗和 /或预防和 /或辅助治疗 HIV感 染相关疾病特别是艾滋病的方法，包括使用有效量的本发明任一项所述 的式 I化合物、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生理毒性的盐或者 本发明的药物组合物的步骤。
当用于上述治疗和 /或预防和 /或辅助治疗时， 治疗和 /或预防和 /或 辅助治疗有效量的一种本发明化合物可以以纯形式应用， 或者以药学 可接受的酯或前药形式 (在存在这些形式的情况下)应用。 或者， 所述 化合物可以以含有该目的化合物与一种或多种药物可接受赋形剂的药 物组合物给药。 词语"有效量 "的本发明化合物指以适用于任何医学预 防和 /或治疗和 /或辅助治疗的合理效果 /风险比治疗障碍的足够量的化 合物。 但应认识到， 本发明化合物和组合物的总日用量须由主诊医师 在可靠的医学判断范围内作出决定。 对于任何具体的患者， 具体的治 疗有效剂量水平须根据多种因素而定， 所述因素包括所治疗的障碍和 该障碍的严重程度； 所采用的具体化合物的活性； 所采用的具体组合 物； 患者的年龄、 体重、 一般健康状况、 性别和饮食； 所采用的具体 化合物的给药时间、 给药途径和排泄率； 治疗持续时间； 与所采用的 具体化合物组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。 例如， 本领域的做法是， 化合物的剂量从低于为得到所需治疗效果而 要求的水平开始， 逐渐增加剂量， 直到得到所需的效果。 一般说来， 本发明式 I化合物用于哺乳动物特别是人的剂量可以介于 0.001-1000 mg/kg体重 /天， 例如介于 0.01-100 mg/kg体重 /天， 例如介于 0.01-10 mg/kg体重 /天。
根据本发明的化合物可以有效地预防和 /或治疗和 /或辅助治疗本 发明所述的各种疾病或病症。 本发明中，
所述 "HIV-1 gp41 N-trimer表面疏水性口袋区"由 gp41 NHR 上 的 LLQLTVWGIKQLQARIL ( SEQ ID NO: 10 )残基构成。
所述 "特异性结合" 即小分子可以作用在疏水性口袋中， 显示出 一定的融合抑制活性。 所述小分子是相对于肽而言， 非肽类的药效团 即称为小分子化合物。 附图说明
图 1: 样品配制示意图。 具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述， 但是本领 域技术人员将会理解， 下列实施例仅用于说明本发明， 而不应视为限 定本发明的范围。 实施例中未注明具体条件者， 按照常规条件或制造 商建议的条件进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通 过市购获得的常规产品。
在本发明中使用的缩写具有下面的含义：
AIDS (Acquired Immure Deficiency Syndrome) 艾滋病， 获得性免疫缺陷综合征 Ala (Alanine, A) 丙氨酸
Asn (Asparagine, N) 天冬 Sfe氛
DCM (Dichloromethane) 二氯甲烷
DMF (Ν,Ν-Dimethyl malonate) 二甲基甲酰胺
Env (Envelope glycoprotein) 包膜糖蛋白
ESI-MS(Electronic spray ion mass spectroscopy)电喷雾质讲
Fmoc (Fluorenylmethoxycarbonyl) 甲氧
Gin (Glutamine, Q) 谷酰氨
Glu(Glutamic acid, E) 谷氨酸
6-HB(six-helix bundle) 六螺旋体
HBTU 2-(1Η-1-羟基苯并三唑 )-l，l，3，3-四甲基脲六氡磷酸
His(Histidine, H) 組氨酸
HoBt(l-Hydroxylbenzotriazole anhydrous) 基笨并三氮峻
HR1 ( N-terminal heptad repeat, NHR ) N末端重复序列
HR2 ( C-terminal heptad repeat, CHR ) C末端重复序列
HIV ( Human Immunodeficiency Virus) ) 人免疫缺陷病毒
HIV-1 人免疫缺陷病毒 I型
HPLC(High performance liquid chromatography)高效液相色讲
Ile(Isoleucine, I) 异亮數酸
Leu(Leucine, L) 亮氛酸
Lys(Lysine, K) 赖氨酸
Ser(Serine, S) 丝氛酸
TFA(trifluoroacetic acid) 三氡乙酸
Thr(Threonie, T) 苏氨酸
Tyr(Tyrosine, Y) 路氨酸 实施例所用固相合成载体 Rink酰胺树脂为天津南开合成责任有 P艮公司产品； HBTU、 HOBT、 DIEA以及 Fmoc保护的天然 ^酸或 D型的非天然氨基酸为上海吉尔生化公司以及成都诚诺新技术有限责 任公司产品。 N-甲基吡咯烷酮（NMP )为 ACROS公司产品； 三氟乙 酸（TFA ) 为北京博迈杰科技有限公司产品； 3,4-二羟基苯乙酸、 4- J ^水杨酸、 5- J ^水杨酸、 2,5-己二酮、 叔丁醇以及溴代乙酸乙酯为 ALFA公司产品； DMF、 DCM为韩国三星公司产品； 色谱纯乙腈为 Fisher公司产品。 其它试剂如无说明均为国产分析纯产品。 实施例 1: 化合物 1的制备
1.1 HT的制备及其与连接臂的连接
中间体 2的合成：
氮气保护下用 18.5ml甲醇溶解 0.2g ( 1.19mmol )化合物 1， 滴入 浓 H2S04 3滴， 避光回流 2小时。 反应结束后蒸干反应液， 用乙酸乙 酯重新溶解， 并用饱和 NaHC03洗三遍。 水相合并， 用乙酸乙酯萃取 三遍后合并酯相， 用饱和 NaCl溶液洗至中性。 酯相用无水 Na2S04干 燥过夜， 蒸干溶剂得中间体 2。 收率 96%。
中间体 3的合成：
氮气保护下将 0.21g(1.19mmol)中间体 2溶于 15ml无水氯仿中， 加入 2,2-二甲
3/4 J ^丙烷（DMP ) 1.6ml, 樟脑磺酸 0.06g(0.24mmol)。 避光回流 4小时， TLC监测反应 （石油醚： 乙醚 =7: 1 )反应结束后 用饱和 NaHC03洗三遍， 氯仿相用无水 Na2S04干燥过夜， 蒸干溶剂 得粗产物。 柱层析分离纯化（石油醚： 乙醚 =80:1 )得中间体 3， 收率 71%。
中间体 4的合成：
氮气保护下将 2.54g ( 11.43mmol ) 中间体 3溶于 100ml无水四氢 呋喃中， 加入 LiAlH4 0.22g(5.72mmol),避光反应 6小时。 反应结束后 加入用水湿润的乙醚 5ml， 后加入水 0.5ml， 有沉淀生成。 滤出沉淀后 溶液用无水 Na2S04干燥过夜，蒸干溶剂得粗产物。柱层析分离纯化 (石 油醚： 乙醚 =15:1 ) 的中间体 4， 收率 70%。
中间体 5的合成：
将 0.2g ( 1.03mmol ) 中间体 4溶于 5ml二氯甲烷中， 加入三乙胺 0.3ml, DMAP O.Olg, 水浴搅拌。 称取丁二酸酐 0.24g(2.4mmol)用 3ml 二氯甲烷溶解， 呈悬浊液， 油浴回流。 10分钟后将中间体 4的二氯甲 烷溶液用恒压漏斗滴入， 滴完后 10分钟反应完全。 用 10%柠檬酸水 溶液洗有 W目 1遍， 后用饱和 NaCl溶液洗至中性， 用无水 Na2S04 干燥过夜。 蒸干溶剂得粗产物。 柱层析分离纯化（石油醚： 乙酸乙酯 =8:1 ) 的化合物 5， 收率 80%。
1.2 HT与肽缀合物 (化合物 1)的制备
化合物 5即为 HT的衍生物。 它和 HT的区别只在于在 HT的羟 基上引入了一个羧酸的结构。 在化合物 5与肽相连后， 这个被引入的 羧酸只起到一个连接臂的作用。 所以不需要从化合物 5制备 HT。
多肽可以委托商业上的公司合成， 也可以参考如下方法合成。 多肽合成采用标准的 Fmoc固相方法。选用 Rink Amide树脂， 肽 链由 C端向 N端延长。 缩合剂为 HBTU/HOBt/DIEA。 脱保护剂为哌 啶 /DMF溶液。 裂解剂为三氟乙酸（TFA ) ， 粗肽水溶解后冻干保存。 用中压液相色讲法或高压液相色讲法 （HPLC )进行分离纯化， 纯肽 含量 &90%。 基盾辅助激光解析飞行时间质讲 ( MALDI-TOF-MS )确 定肽序列分子量。
利用 CEM微波多肽合成仪合成肽序列，小分子化合物可以作为最 后的残基与多肽 N 端氨基缩合,然后在多肽裂解条件下脱去羟基保护 基,最后得到小分子-多肽缀合物。
合成条件如下：
保护氨基酸或小分子化合物： 0.2M 的 DMF溶液，
活化剂： 0.45M HBTU/HOBt 的 DMF溶液，
活化碱： 2M DIEA 的 NMP溶液，
脱保护剂： 20% v/v哌啶的 DMF溶液，
封闭试剂： 20% v/v 乙酸酐的 DMF溶液。
称取 Rink Amide树脂 0.5g(0.25mmol)置入 CEM微波多肽合成仪 反应器中， 然后将氨基酸， 小分子， 活化剂， 活化碱， 脱保护试剂， 封闭试剂按上述浓度配制好后， 用 CEM微波全自动多肽合成仪进行 合成。 完成后肽树脂用 DMF洗涤 3遍后用无水甲醇收缩， 室温真空 干燥， 得肽树脂 2.05g。
裂解液 (体积百分比)： 三氟乙酸： 乙二硫醇： 间甲盼： 水 = 82.5 ： 10 ： 5 ： 2.5。
肽树脂（连接小分子 HT )的裂解： 称取微波合成仪合成好的肽树 脂 2.05g， 放入 250ml茄形瓶中， 水浴， 电磁搅拌。 按 1克肽树脂加入 10ml的量配制裂解液。 TFA需预先水浴降温 30min或者预先存放于 水箱中使用； 将配制好的裂解液加入到水浴条件下的肽树脂中， 电磁 搅拌， 树脂变橙红色， 水浴条件下反应 30min, 然后， 撤水浴， 室温 再继续搅拌反应 90min, 反应完成。 剧烈搅拌下向反应器中加入冷乙 醚 200ml， 析出白色沉淀， 继续搅拌 30 用 G4的砂芯抽虑漏斗滤 出析出物，用冷乙醚反复洗涤 3遍，晾干。加入双蒸水 50ml， 乙腈 5ml 使固体充分溶解， 抽虑， 滤液冻干得 N端连接小分子的粗肽 1.03g。
所得连接小分子的粗肽用中压或高压色讲进行纯化。色讲柱为 C8 柱， 洗脱剂为乙腈， 水及少量乙酸。 具体操作步骤： 称取粗肽 l.OOg, 加水 20ml， 乙腈 5ml使固体溶解， 离心 10min(3000转 /分钟)， 取上清 液上样。 色讲柱预先用 15%乙腈 /水 /0.1%水乙酸溶液 200ml平衡。 上 样后继续用 15%乙腈 /水 /0.1%水乙酸溶液 200ml冲洗， 高效液相检测 洗脱液成分。 根据液相检测结果逐渐升高乙腈含量， 直至所纯化的多 肽缀合物主峰被洗脱出来。 合并洗脱液， 旋转蒸发去除大部分溶剂， 冻干得纯的小分子 -多肽缀合物（化合物 1 )，HPLC检测含量大于 90%。 实施例 2 - 7: 化合物 2 - 7的制备
方法同实施例 1， 只是连接小分子与多肽的连接臂 ( linker )分别 替换为 β -丙氨酸 ( β Ala ) , 6- J ^己酸 ( Aca ) , PEd, PEG2, PEG3 将上述作为连接臂的化合物先分别与多肽连接， 再与小分子连接， 得 到化合物 2 -化合物 7。 实施例 8: 化合物 8的制备
胆固醇溴代乙酸酯（Chol-Br ) 的合成
依次称取溴乙酸 6.95g， 胆固醇 7.73g， EDC*HC1 13.43g, DMAP 122mg加入 500ml茄形瓶中， 加入 DCM 500ml， 水浴下搅拌， 溶液呈 黄色。 30min后撤除水浴， 室温下反应 24h, 溶液呈红褐色。 依次用 饱和 NaHC03、 饱和 NaCl洗涤， 无水 MgS04干燥。 适当浓缩后用硅 胶柱湿法装柱上样纯化。 先用石油醚： 乙酸乙酯 =10: 1作为洗脱剂洗 脱 500ml之后将洗脱剂更换为石油醚： 乙酸乙酯 =9: 1， 洗脱下产物， 蒸除溶剂， 真空干燥后得到白色固体 6.3g， 产率 62%。
首先按实施例 1的方法合成多肽， 然后取纯化后的多肽（&90% ) 20mg溶于 0.3ml DMSO中，分别加入 0.2ml Chol-Br 3.0mg的 THF溶 液， 混合均匀后用滴管加入 DIEA 2滴， 室温反应 3h， 用 C4半制备 反相色谱柱分离纯化， MALDI-TOF-MS确证分子量。 实施例 9 - 15: 化合物 9 - 15的制备
首先按实施例 1的方法合成小分子 HT与多肽缀合物， 然后再按 实施例 8 的方法与胆固醇连接， 得到目标化合物， MALDI-TOF-MS 确证分子量。 实施例 16 - 30: 化合物 16 - 30的制备 分别按实施例 1， 实施例 8和实施例 9的方法合成多肽与小分子 HT缀合物， 只是将多肽序列进行变化。 实施例 31: 化合物 31的制备
1. 小分子化合物 MNB2的合成： 将 NB2苯环羧基用叔丁酯保护， 使其 羟基与溴乙酸乙酯反应， 后经皂化水解酯键为羧基， 以便与连 接臂或多 N端进行反应。 合成路线如下：
中间体 2的合成：
称取 4-硝基水杨酸 0.2g于 50ml茄形瓶中， 加入 DMAP 0.006g, 加入叔丁醇 3ml溶解， 呈悬浊液。 称取 DCC 0.24g， 用 3ml无水 THF 溶解。 用衡压漏斗将上述溶液滴入到茄形瓶中， 回流 4小时。 反应完 全后蒸干溶剂， 用乙酸乙酯重新溶解， 后用饱和 NaHC03洗三遍、 饱 和 NaCl溶液洗三遍， 无水 Na2S04干燥过夜。石油醚： 乙酸乙酯 =20:1 过柱纯化。
中间体 3的合成：
中间体 2用 3ml 2-丁酮溶解， 加入固体 K2C03 0.15g, 加热回流 30分钟。 在上述溶液中加入溴乙酸叔丁酯 0.22g， 继续回流 3小时。 反应完全后加入水 15ml， 用氯仿萃取一遍， 氯仿层用 5%NaOH洗两 遍后用饱和 NaCl溶液洗三遍， 无水 Na2S04干燥过夜。 蒸干后得棕色 油状物。 柱层析分离纯化（石油醚： 乙酸乙酯 =8:1 ) ， 得无色油状物 0.18g,, 收率 80%。
中间体 4的合成：
称取 0.2g中间体 3并溶解于 5ml无水甲醇中。 加入 10% Pd/C 0.02g, 50psi下催化氢化。 反应 1小时后滤去 5% Pd/C, 蒸干溶液得 无色油状物， 直接用于下步反应。 收率 98%。
中间体 5的合成：
称取中间体 4 0.3g， 用 5ml甲苯溶解。 加入 NMM O.lml, 2,5-己 二酮 0.23g， 对甲基苯磺酸 O.Olg, 回流 5小时。 反应完成后放置室温， 减压蒸除溶剂得棕红色油状物。加入乙酸乙酯 15ml溶解产物，并用饱 和 NaCl溶液洗三遍， 无水 Na2S04干燥过夜。 柱层析分离纯化（石油 醚： 乙酸乙酯 =30:1 ) ， 得无色油状物。 产率 70%。
中间体 6的合成：
上述所得油状物用 3ml甲醇溶解， 水浴下滴加 lN NaOH lml。 反 应 15分钟后用 1N盐酸中和。 减压蒸除部分溶剂后再用 1N盐酸调 有白色固体析出， 得化合物 7。 产率 95%。
2. 小分子 MNB2与多肽的连接
按照实施例 1中 1.2的方法合成 MNB2与多肽的缀合物。 实施例 32 - 58: 化合物 32 - 58的制备
分别按照实施例 31，实施例 8以及实施例 9的方法合成化合物 32 - 58， MALDI-TOF-MS确证分子量。 实施例 59: 化合物 59的制备
1. 小分子化合物 A12L的合成：
按如下合成路线合成羧基保护的 A12，并使其盼羟基成醚， 降低修 饰所引起的对电性的影响并利用羧甲基的^^与多肽 N端结合。
中间体 2的合成：
称取 5-硝基水杨酸 0.2g于 50ml茄形瓶中， 加入 DMAP 0.006g, 加入叔丁醇 3ml溶解， 呈悬浊液。 称取 DCC 0.24g， 用 3ml无水 THF 溶解。 用衡压漏斗将上述溶液滴入到茄形瓶中， 回流 2小时。 反应完 全后蒸干溶剂， 用乙酸乙酯重新溶解， 后用饱和 NaHC03洗三遍、 饱 和 NaCl溶液洗三遍， 无水 Na2S04干燥过夜。石油醚： 乙酸乙酯 =20:1 过柱纯化。
中间体 3的合成：
中间体 2用 3ml 2-丁酮溶解， 加入固体 K2C03 0.15g, 加热回流 30分钟。 在上述溶液中加入溴乙酸叔丁酯 0.22g， 继续回流 3小时。 反应完全后加入水 15ml， 用氯仿萃取一遍， 氯仿层用 5%NaOH洗两 遍后用饱和 NaCl溶液洗三遍， 无水 Na2S04干燥过夜。 蒸干后得棕色 油状物。 柱层析分离纯化（石油醚： 乙酸乙酯 =8:1 ) ， 得无色油状物 0.18g,, 收率 80%。
中间体 4的合成：
称取 0.2g中间体 3并溶解于 5ml无水甲醇中。 加入 10% Pd/C 0.02g, 50psi下催化氢化。 反应 1小时后滤去 5% Pd/C, 蒸干溶液得 无色油状物， 直接用于下步反应。 收率 98%。 中间体 5的合成：
称取中间体 4 0.3g， 用 5ml甲苯溶解。 加入 NMM O.lml, 2,5-己 二酮 0.23g， 对甲基苯磺酸 O.Olg, 回流 5小时。 反应完成后放置室温， 减压蒸除溶剂得棕红色油状物。加入乙酸乙酯 15ml溶解产物，并用饱 和 NaCl溶液洗三遍， 无水 Na2S04干燥过夜。 柱层析分离纯化（石油 醚： 乙酸乙酯 =30:1 ) ， 得无色油状物。 产率 70%。
中间体 6的合成：
上述所得油状物用 3ml甲醇溶解， 水浴下滴加 lN NaOH lml。 反 应 15分钟后用 1N盐酸中和。 减压蒸除部分溶剂后再用 1N盐酸调 有白色固体析出， 得化合物 7。 产率 95%。
2. 小分子化合物 A12L与多肽缀合物的制备
按照实施例 1中 1.2的方法合成 A12L与多肽的缀合物。 实施例 60 - 86: 化合物 60 - 86的制备
分别按照实施例 59，实施例 8以及实施例 9的方法合成化合物 60 - 86, MALDI-TOF-MS确证分子量。 实施例 87: 化合物 87的制备
1.小分子化合物 MA12的合成：
按如下合成路线合成用苄酯保护苯环羧基， 并在其吡咯环的 3位 引入 以便与肽链相连的小分子化合物 MA12。
中间体 2的合成：
在茄瓶中加入乙酰乙酸叔丁酯（ 5.0ml， 0.03mol )，无水乙醇 25ml， 水浴冷却到 0?。 滴入乙醇钠 （12.3ml， 0.03mol )保持水浴条件反应 15 分钟。 将上述混合液加入到搅拌的化合物 6 ( 2.2ml, 0.03mol ) 的 无水乙醇 /甲苯 [30ml， V (无水乙醇)： V (甲苯 )=2:1]溶液中， 室温搅拌 4 小时。 加入 2N HC1酸化至中性， 蒸除乙醇后加入 EtOAc,有机相水 洗三次， 无水 MgS04干燥。 化合物 7的粗品经硅胶柱层析纯化 [V (石 油醚)： V (乙酸乙酯) =7: 2]得 3.79g浅黄色液体。 收率 57.80%。
中间体 4的合成：
在茄瓶中加入 5- J ^水杨酸（1.80g， 6.44mmol ) ， 用 30ml甲苯 溶解。 加入 N-甲基吗啉（0.71ml， 6.44mmol ) ， 化合物 2 ( 1.52g, 6.44mmol )及对甲苯磺酸 0.08g。 加热回流反应 3小时后冷却至室温。 减压蒸除溶剂后加入乙酸乙酯溶解， 有; W目水洗 3 次， 无水 MgS04 干燥。化合物 4的粗品经硅胶柱层析纯化 [V (石油醚)： V (乙酸乙酯) =9: 1]得 1.02g浅黄色液体。 收率 65.12%。
中间体 5的合成：
化合物 4 (lO.Og, 0.04mol)用 30ml CH2C12及 5ml DMF溶解， 溶解 后加入苄醇（12.85g, 0.12mol ) ,DCC ( 9.0g, 0.04mol )及 4-吡咯烷基 吡啶 1.0g， 室温搅拌 12小时， TLC监测反应进程。 反应完成后蒸除 溶剂， 加入乙酸乙酯 200ml反应物， 滤除 DCU。 有机相依次用饱和 NaHC03, 5%柠檬酸， H20洗涤， 无水 MgS04干燥。 化合物 5的粗品 经硅胶柱层析纯化 [V (石油醚)： V (乙酸乙酯) =7: 2]得 5.8g无色油状物， 收率 42.12%。
中间体 6的合成：
中间体 5中加入 6N HCl/EtOAc溶液， 室温搅拌至原料点消失， 蒸除溶剂后加入石油醚， 置于水箱中，得浅褐色粉末 1.3g。 收率 83%。
2. 小分子 MA12与多肽缀合物的制备
按照实施例 1中 1.2的方法合成 MA12与多肽的缀合物。 实施例 88 - 114: 化合物 88 - 114的制备
分别按照实施例 87，实施例 8以及实施例 9的方法合成化合物 88 - 114， MALDI-TOF-MS确证分子量。 实施例 115: 化合物 115的制备
1. NB2 的保护与连接臂的引入：将 NB2苯环 用苄酯保护， 然后在其吡咯环的 3位引入一个羧基， 以便与连接臂或多肽 N端进行 反应。 合成路线如下：
中间体的 2合成：
化合物 1 (lO.Og, 0.04mol)用 30ml CH2C12及 5ml DMF溶解， 溶解 后加入苄醇（12.85g, 0.12mol ) ,DCC ( 9.0g, 0.04mol )及 4-吡咯烷基 吡啶 1.0g， 室温搅拌 12小时， TLC监测反应进程。 反应完成后蒸除 溶剂， 加入乙酸乙酯 200ml反应物， 滤除 DCU。 有机相依次用饱和 NaHC03, 5%柠檬酸， H20洗涤， 无水 MgS04干燥。 化合物 2的粗品 经硅胶柱层析纯化 [V (石油醚)： V (乙酸乙酯) =7: 2]得 6.2g无色油状物， 收率 45.76%。
中间体 3的合成：
在化合物 2 ( 6.2g, 0.02mol ) 中加入 4N HCl/EtOAc溶液， 室温搅 拌 1小时， 蒸干反应液得化合物 2 (白色固体） ， 直接用于下步反应。
中间体 6的合成：
在三口瓶中加入丙酮 （508ml, 6.90mol ) ， H20 1000ml, KC103 ( 120g, l.lOmol ) 。 机械搅拌下滴入 Br2 ( 206ml, 4.00mol ) ， 约 1.5 小时滴完。 继续搅拌至反应液无色， KC103完全溶解， 反应完成。 萃 取分离，有;^目中加入 MgO振摇， 水洗 3次后用无水 CaCl2干燥。 减 压蒸嬸， 收集沸点为 50-51?镏分， 得无色刺激性液体 140.9g。 收率 14.93%。
中间体 7的合成：
在茄瓶中加入乙酰乙酸叔丁酯（ 5.0ml， 0.03mol )，无水乙醇 25ml， 水浴冷却到 0?。 滴入乙醇钠 （12.3ml， 0.03mol )保持水浴条件反应 15 分钟。 将上述混合 3/4
入到搅拌的化合物 6 ( 2.2ml, 0.03mol ) 的 无水乙醇 /甲苯 [30ml， V (无水乙醇)： V (甲苯 )=2:1]溶液中， 室温搅拌 4 小时。 加入 2N HC1酸化至中性， 蒸除乙醇后加入 EtOAc,有机相水 洗三次， 无水 MgS04干燥。 化合物 7的粗品经硅胶柱层析纯化 [V (石 油醚)： V (乙酸乙酯) =7: 2]得 3.79g浅黄色液体。 收率 57.80%。
中间体 8的合成：
在茄瓶中加入化合物 3 ( 1.80g, 6.44mmol ) ， 用 30ml甲苯溶解。 加入 N-甲基吗淋（0.71ml， 6.44mmol ) , 化合物 7 ( 1.52g， 6.44mmol ) 及对甲苯磺酸 0.08g。加热回流反应 3小时后冷却至室温。 减压蒸除溶 剂后加入乙酸乙酯溶解， 有机相水洗 3次， 无水 MgS04干燥。 化合物 8的粗品经硅胶柱层析纯化 [V (石油醚)： V (乙酸乙酯) =9: 1]得 1.91g浅 黄色液体。 收率 70.48%。
目标化合物 (化合物 9 ) 的合成：
将中间体 8中加入 6N HCl/EtOAc溶液，室温搅拌至原料点消失， 蒸除溶剂后加入石油醚， 置于水箱中，得浅褐色粉末 1.3g。 收率 83%。 115.2 小分子化合物 NB2L与多肽的连接
按照实施例 1.2的方法合成 NB2L与多肽的缀合物。 实施例 116 - 142: 化合物 116 - 142的制备
分别按照实施例 115， 实施例 8以及实施例 9的方法合成化合物 116 - 142， MALDI-TOF-MS确证分子量。 实施例 143: 化合物抑制 HIV-1 介导的细胞 -细胞融合活性评价 ( ICn )
1. TZM-bl细胞和 HL2/3细胞的复苏 /冻存
将细胞冻存管从液氮中取出， 37?水浴迅速升温， 取出细胞冻存液 ( lml ),加至 15ml离心管，并加入 1ml培养基，离心（ 800rpm， lOmin ), 除去培养基， 重新加入 lml新鲜培养基， 并轻吹使细胞均匀悬浮， 将细 胞悬浮液^转移至含有 15ml培养基的 75cm2培养瓶中， 在 37?、 5%C02下培养。
消化细胞并计
1/2 ， 离心， 弃上清， 加冻存液轻吹使细胞均匀悬浮 ( 100万 /ml )，分装至冻存管（ lml/管 )，分别置于 4? ( 30min )、 -20 ? ( 2h ) 、 -80 ? ( 12h ) 、 -196? ^。
2.传代培养
取出细胞培养瓶， 倒去培养基， 加入 2ml消化液， 轻晃使其在细胞 表面平铺均匀，倒去消化液，重新加入 2ml消化液，铺匀，37?消化 2min， 加入 4ml培养 Jf止消化， 取出所有液体， 离心， 弃上清， 加 4ml培养 基并轻吹使细胞均匀悬浮， 取 ΙΟ μ Ι计数， 取 40-50万细胞置于 75cm2 培养瓶中传代培养。
3. 融合实臉
A. 取 TZM-bl细胞（由美国 NIH AIDS Research and Reference Reagent Program提供 )悬浮液稀释至 50万 /ml, 铺入 96孔细胞培养 板， 50 μ 1/孔， 培养 24h。
B. 配样品： 取待测化合物， 先估计化合物的 IC50值， 以这个估 计的值为基础， 乘以两个 4， 再乘以 6得到待测化合物的配制浓度， 例 如：估计样品的 IC50为 ΙΟηΜ,则样品的配制浓度为 10*4*4*6=960nM, 以此浓度为基础， 在 96孔板上第 (1-10)列依次将待测化合物稀释四倍， 11列和 12列为空白溶剂 （空白溶剂即只^^养基， 不含待测样品， 其 中 11列为阳性对照， 为无样品抑制剂条件下以 1:3浓度混合的 TZM-bl 细胞和 HL2/3细胞； 12列为阴性对照，为单一 TZM-bl细胞的化学发光 信号）； DMSO含量 & 6%。
样品配制说明：每个 96孔样品板（每行 12孔，共 8行； Costar 3799, Corning Incorporation, USA )配制 4个样品， 每个样品重复 1次， 如 图 1所示， 以第一行为例将选定浓度的样品放置第 S1孔， 序列稀释 4 倍（即后一个孔的样品浓度是前一个孔的 1/4 ) ， 按此稀释 10个浓度梯 度。 两个孔作为对照只含有培养基， 其中第 11 孔含有靶细胞和效 应细胞为 100%融合对照（阳性对照）， 第 12孔只含靶细胞为无融合背 景对照（阴性对照） 。
C. 取 HL2/3细胞（由美国 NIH AIDS Research and Reference Reagent Program提供 )悬浮液稀释至 100万 /ml,加入细胞板的 (1-11) (A-H), 50 μ 1/孔， 第 12 X (Α-Η)补加 50 μ 1/孔培养基。
D. 立即取步骤 Β中的 20 μ ?/孔样品加入细胞板， 培养 6h。
E. 去除细胞板中每孔中的培养基（120 μ 1/孔） ， 以 PBS 洗 2 次， 150 μ ?/次。
加入稀幹后的裂解液（ 1 X )， 50 μ 1/孔， 裂解 5 其中稀幹后的 裂解液（I X ) 即将 Luciferase试剂盒（Promega, USA ) 中 （5 x ) 的 裂解液用 ^释， 才艮据用量新鲜配制。
F. 取 20 μ 1/孔细胞裂解液铺在 96孔磷t^Lh。
G. 将融化后的 LA緩冲液 ( Luciferase Assay Buffer, Promega Cooperation, USA )加入 LA底物 ( Luciferase Assay Substrate, Promega Cooperation, USA ) 中混匀， 加 40 μ 1/孔于 96孔磚光板中。
Η. 立即在酶标仪上检测发光。 实验的阴性对照为单一 TZM-bl细 胞的化学发光信号， 用 Min表示； 阳性对照为无样品抑制剂条件下以 1:3浓度混合的 TZM-bl细胞和 HL2/3细胞， 用 Max表示； 测定值为某 一样品在某一浓度下的信号值， 用 X表示； 细胞融合率 = ( X-Min ) / ( Max-Min ) *100%。
按照上述方法， 活性测定结果见下面的表 1。
表 1: 抑制 HIV-1介导的细胞融合活性（ IC50 ) 编 抑制活性 序 列
号 ( IC50 ) μ Μ 1 HT NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 68.052士 25.895 2 HT- β Ala- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 46.357士 5.6275 3 HT~Aca~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 84.043 ± 16.476 4 HT-2Aca~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 47.087士 3.7468 5 HT~PEGi~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 123.05士 67.056 6 HT~PEG2~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 36.476 ±3.5698 7 HT~PEG3~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 56.776士 16.747 8 NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 2.3676 ± 0.0464 9 HT--NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 0.0248 ± 0.0443 10 HT- β Ala- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 0.0075士 0.0014 11 HT~Aca~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 0.0068士 0.0054 12 HT-2Aca~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 0.0062 ± 0.0004 13 HT~PEGi~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 0.0097 ± 0.0042 14 HT~PEG2~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 0.0067士 0.0006 15 HT~PEG3~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 0.0046士 0.0006 16 HT INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 67.083 ± 6.0793 17 HT- β Ala- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 46.077士 8.6405 18 HT~Aca~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 66.055士 14.075 19 HT-2Aca~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 45.065士 33.778 20 HT~PEGi~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 79.068 ± 37.077 21 HT~PEG2~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 67.486 ± 23.098 22 HT~PEG3~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 65.756士 22.046 INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 0.0134士 0.0653 HT-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 0.0128士 0.0063 HT- β Ala- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 0.0095 ± 0.0005 HT~Aca~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 0.0056士 0.0084 HT-2Aca~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 0.0066士 0.0007 HT~PEGi~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0049士 0.0008 Ala-C-Chol
HT~PEG2~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0065士 0.0004 Ala-C-Chol
HT~PEG3~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0056 ± 0.0006 Ala-C-Chol
MNB2 NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 56.063 ± 5.0593 MNB2- β Ala- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 67.047 ± 8.8605 MNB2~Aca~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 86.055士 17.075 MNB2-2Aca~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 47.065士 6.0787 MNB2~PEGi~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 99.068 ± 67.064 MNB2~PEG2~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 26.476 ± 4.0560 MNB2— PEG3~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 31.232士 2.4325 MNB2 NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 0.0098士 0.0563 MNB2- β Ala- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0025 ± 0.0003 Ala-C-Chol
MNB2~Aca~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0089士 0.0564 Ala-C-Chol
MNB2-2Aca~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0038士 0.0002 Ala-C-Chol
MNB2~PEGi~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0076 ± 0.0007 Ala-C-Chol
MNB2~PEG2~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0067士 0.0008 Ala-C-Chol MNB2~PEG3~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0046士 0.0009 Ala-C-Chol
MNB2 INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 34.023 ± 5.0693 MNB2- β Ala- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 45.097士 8.0005 MNB2~Aca~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 67.015 ± 10.005 MNB2-2Aca~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 38.005 ± 6.0707 MNB2~PEGi~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 69.098 ± 36.084 MNB2--PEG2-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 21.456 ± 4.0530 MNB2--PEG3-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 34.056 ± 9.0079 MNB2 INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 0.0236 ± 0.0693 MNB2- β Ala- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0097 ± 0.0005 Ala-C-Chol
MNB2~Aca~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0154士 0.0054 Ala-C-Chol
MNB2-2Aca~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0075 ± 0.0007 Ala-C-Chol
MNB2--PEG1-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0098士 0.0034 Ala-C-Chol
MNB2--PEG2-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0065 ± 0.0030 Ala-C-Chol
MNB2--PEG3-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0078士 0.0069 Ala-C-Chol
A12L NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 23.043 ± 5.3293 A12L - β Ala- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 35.093 ± 2.3331 A12L ~Aca~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 25.415 ± 4.0021 A12L -2Aca~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 38.005 ± 6.0707 A12L --PEG1-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 29.009士 12.331 A12L ~PEG2~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 43.212 ± 4.2231 A12L ~PEG3~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 43.235士 1.2213 A12L NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0236 ± 0.0693 Ala-C-Chol
A12L - β Ala- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0097 ± 0.0005 Ala-C-Chol
A12L ~Aca~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0154士 0.0054 Ala-C-Chol
A12L -2Aca~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0075 ± 0.0007 Ala-C-Chol
A12L ~PEGi~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0098士 0.0034 Ala-C-Chol
A12L ~PEG2~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0065 ± 0.0030 Ala-C-Chol
A12L ~PEG3~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0078士 0.0069 Ala-C-Chol
A12L INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 54.095士 4.754 A12L - β Ala- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 42.655士 7.3568 A12L ~Aca~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 38.9876 ± 2.852 A12L -2Aca~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 17.643士 0.5566 A12L ~PEGi~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 22.678士 0.5014 A12L ~PEG2~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 49.366 ± 8.7893 A12L ~PEG3~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 67.624 ± 24.036 A12L INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0078士 0.0069 Ala-C-Chol
A12L - β Ala- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0236 ± 0.0693 Ala-C-Chol
A12L ~Aca~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0097 ± 0.0005 Ala-C-Chol
A12L -2Aca- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0154士 0.0054 Ala-C-Chol
0869.0/CTOZN3/X3d S.SS8l/CT0Z OAV
由表 1活性结果可见，所有小分子-多肽缀合物均显示了抑制 HIV-1 细胞融合活性， 其中化合物 8-15、 23-30、 38-44、 52-58、 66- 72、 80— 86、 94— 100、 108— 114、 22— 128、 136— 142抑制 HIV融合 活性达到低的 nM水平， 与阳性对照药 T20 (化合物 144 )和 C34 (化 合物 W3)相当。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述， 本领域技术人 员将会理解。 根据已经公开的所有教导， 可以对那些细节进行各种修 改和替换， 这些改变均在本发明的保护范围之内。 本发明的全部范围 由所附权利要求及其任何等同物给出。
& 2004-. All rights reserved.}
WIPO Patent Application WO/
Disclosed is anti-HIV infection polypeptide. The present invention relates to polypeptide expressed in formula I, derivative thereof, stereisomer thereof, or salt thereof with no physiological toxicity. Also disclosed are a pharmaceutical composition containing the polypeptide in formula I, the derivative thereof, the stereisomer thereof, or the salt thereof with no physiological toxicity, and use of the polypeptide in formula I, the derivative thereof, the stereisomer thereof, or the salt thereof with no physiological toxicity in treating or preventing related diseases caused by HIV infection, especially acquired immunodeficiency syndrome (AIDS).
Inventors:
LIU, Keliang (No.27, Taiping Road Haidian District, Beijing 0, 100850, CN)
WANG, Chao (No.27, Taiping Road Haidian District, Beijing 0, 100850, CN)
SHI, Weiguo (No.27, Taiping Road Haidian District, Beijing 0, 100850, CN)
CAI, Lifeng (No.27, Taiping Road Haidian District, Beijing 0, 100850, CN)
WANG, Kun (No.27, Taiping Road Haidian District, Beijing 0, 100850, CN)
FENG, Siliang (No.27, Taiping Road Haidian District, Beijing 0, 100850, CN)
HAN, Han (No.27, Taiping Road Haidian District, Beijing 0, 100850, CN)
Application Number:
Publication Date:
12/19/2013
Filing Date:
06/08/2013
Export Citation:
INSTITUTE OF PHARMACOLOGY AND TOXICOLOGY ACADEMY OF MILITARY MEDICAL SCIENCES P.L.A. CHINA (No.27, Taiping Road Haidian District, Beijing 0, 100850, CN)
International Classes:
C07K14/16; A61K38/16; A61P31/18
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Domestic Patent References:
Foreign References:
Other References:
ZHAO LEI ET AL.: 'A multi-functional peptide as an HIV- entry inhibitor based on self-concentration, recognition, and covalent attachment' ORGANIC & BIOMOLECULAR CHEMISTRY vol. 10, August 2012, pages 6512 - 6520
Attorney, Agent or Firm:
CCPIT PATENT AND TRADEMARK LAW OFFICE (8th Floor, Vantone New World Plaza2 Fuchengmenwai Street, Xicheng District, Beijing 7, 100037, CN)
权 利 要 求
1. 式 I所示的化合物、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生理毒 性的盐，
Sm - Li - A - L2 - Choi 式 I 其中，
Sm为小分子化合物， 例如能够与 HIV-1 gp41 N-trimer表面疏水 性口袋区特异性结合的小分子化合物； 或者 Sm缺失；
为连接多肽 A与 Sm间的连接臂， 例如为使得 Sm能够保持空 间灵活性而与靶标即 HIV-1 gp41 N-trimer表面疏水性口袋区结合的 连接多肽 A与小分子间的连接臂； 或者 缺失；
多肽 A的 ^^^列为 INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 或者 NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
为连接多肽 A与胆固醇分子间的连接臂；
Choi为胆固醇。
2. 根据权利要求 1所述的化合物、 其衍生物、 其立体异构体、 或 其无生理毒性的盐，
Sm选自如下小分子化合物：
3. 根据权利要求 1或 2所述的化合物、其衍生物、其立体异构体、 或其无生理毒性的盐，
其中， ^和^独立地选自天然或非天然氨基酸、 二酸、 二胺、 二 醇， 以及一端为氨基或者一端为羧基的聚乙二醇。
4. 根据权利要求 1至 3中任一项所述的化合物、 其衍生物、 其立 体异构体、 或其无生理毒性的盐，
其中， ^和^独立地选自：
L型或 D型的： 甘氨酸（Gly) ， 丙氨酸 (Ala), 亮氨酸（Leu) , 异亮氨酸 (He), 谷氨酸（Glu) ,谷酰胺（Gin) ,天冬氨酸（Asp) ， 天冬酰胺（Asn) , 缬氨酸（Val) ,赖氨酸 (Lys), 丝氨酸（Ser) , 苏 氨酸（Thr ) ,精氨酸（ Arg ) , 组氨酸（His ) , 色氨酸（ Trp ) , 苯丙 氨酸（Phe ) , 酪氨酸（Tyr ) , 半胱氨酸（ Cys )、 甲硫氨酸（Met )；
Y - J ^丁酸（GABA )
6- J ^己酸 (Aca);
乙二酸、 丙二酸、 丁二酸、 戊二酸、 己二酸；
乙二胺、 丙二胺、 丁二胺、 戊二胺、 己二胺；
乙二醇、 丙二醇、 丁二醇、 戊二醇、 己二醇；
NH2-CH2CH2-0-CH2CH2-COOH(PEG1);
NH2-CH2CH2-0-CH2CH2-0-CH2CH2 COOH(PEG2); 和 NH2-CH2CH2-0-CH2CH2-0-CH2CH2-0-CH2CH2-COOH(PEG3)。
5.根据权利要求 1所述的式 I化合物、其衍生物、其立体异构体、 或其无生理毒性的盐， 其中， 所述式 I化合物选自如下的化合物： HT NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
HT- β Ala- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
HT—Aca— NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
HT-2Aca-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
HT--PEGi-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
HT--PEG2-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
HT--PEG3-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C
HT-NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C
HT- β Ala- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C HT—Aca— NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C HT-2Aca-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C HT--PEGi-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C HT--PEG2-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C HT--PEG3-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C HT INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
HT- β Ala- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
HT—Aca— INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
HT-2Aca-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
HT--PEGi-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
HT--PEG2-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
HT--PEG3-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C
HT-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C
HT- β Ala- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C HT—Aca— INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C HT-2Aca-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C HT--PEG!--INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C HT--PEG2--INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C HT--PEG3--INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C ΜΝΒ2 NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL；
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MNB2--PEG2-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
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MNB2- β Ala- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
MNB2--Aca-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
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A12L -2Aca-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
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A12L --PEG3-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
A12L -NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C
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A12L—Aca— INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
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NB2L -PEG2- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
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NB2L - β Ala- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
NB2L -Aca-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL; NB2L -2Aca-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
NB2L -PEGi- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL；
NB2L -PEG2- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL；
NB2L -PEG3- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL；
NB2L -INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C
NB2L- β Ala-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β Ala-C-C NB2L-Aca--INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β Ala-C-C NB2L-2Aca-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β Ala-C-C NB2L-PEG!-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β Ala-C-C NB2L-PEG2-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β Ala-C-C 和
NB2L-PEG3-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β Ala-C-Chol。
6. 一种药物组合物，其含有至少一种权利要求 1至 5中任一项所 述的式 I化合物、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生理毒性的盐； 可选地， 其还包含药学上可接受的载体或辅料； 具体地， 所述药物组 合物为 HIV融合抑制剂。
7. 权利要求 1至 5中任一项所述的式 I化合物、 其衍生物、 其立 体异构体、 或其无生理毒性的盐或者权利要求 6所述的药物组合物在 制备抑制 HIV融合的药物或者试剂例如 HIV融合抑制剂中的用途。
8. 权利要求 1至 5中任一项所述的式 I化合物、 其衍生物、 其立 体异构体、 或其无生理毒性的盐或者权利要求 6所述的药物组合物在 制备用于治疗和 /或预防和 /或辅助治疗 HIV感染相关疾病特别是艾滋 病的药物中的用途。
9. 一种在体内或体外抑制 HIV融合的方法， 包括使用有效量的 权利要求 1至 5中任一项所述的式 I化合物、 其衍生物、 其立体异构 体、 或其无生理毒性的盐或者权利要求 6所述的药物组合物的步骤。
10.一种治疗和 /或预防和 /或辅助治疗 HIV感染相关疾病特别是艾 滋病的方法， 包括使用有效量的权利要求 1至 5中任一项所述的式 I 化合物、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生理毒性的盐或者权利要 求 6所述的药物组合物的步骤。
Description:
抑制 HIV感染的小分子 -多肽缀合物 技术领域
本发明属于医药化工领域， 涉及一种抑制 HIV感染的小分子与多 肽缀合物。 具体地， 本发明涉及式 I所示的化合物 （缀合物） 、 其衍 生物、 其立体异构体、 或其无生理毒性的盐。 本发明还涉及含有上述 的式 I化合物、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生理毒性的盐的药 物组合物， 以及式 I化合物、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生理 毒性的盐在制备治疗和 /或预防和 /或辅助治疗 HIV感染所致相关疾病 尤其是获得性免疫缺陷综合征 ( AIDS, 即艾滋病） 的药物中的用途。
Sm - Li - A - L2 - Choi 式 I 。
艾滋病主要是由于人免疫缺陷病毒 I型 （HIV-1 )感染导致的致 死性传染疾病， 在全球范围流行。 目前临床上应用的抗 HIV-1药物， 辅以高效抗逆转录病毒疗法，可以在一定程度上延长 HIV感染者的生 存时间和改善其生活质量。 但是， 由于 HIV疫苗研究进展緩慢以及耐 药性问题日益明显， 研发新型抗 HIV药物仍是当务之急。
Gp41是介导 HIV-1与靶细胞膜融合的特异性蛋白， 是融合抑制剂 的作用靶标。 Gp41 的胞外区存在着两个与膜融合密切相关的螺旋结构 功能区， 即 N末端重复序列 （HR1 )和 C末端重复序列 （HR2 ) 。 在 膜融合过程中， HR2 与 HR1 相互作用， 形成一个六螺旋体核心结构 ( 6-HB ) 。
HIV融合抑制剂 （ HIV fusion inhibitors )是干扰病毒进入靶细胞 的新型抗 HIV药物， 其在感染的初始环节切断病毒的传播， 这对于预 防及控制 HIV-1感染具有特殊意义，因而成为新机制抗 HIV药物研究 的热点。
T20是衍生于 gp41 HR2区域的具有 36个氨基酸残基的融合抑制 多肽， 于 2003年经美国 FDA批准上市， 是目前唯一上市的 HIV-1融 合抑制剂。 T20能竟争性的和 HR1构成的螺旋三聚体结合， 占据 HR2 的作用位点， 进而抑制 6-HB的形成， 使得膜融合过程不能完成。
T20的上市开辟了多肽类药物控制 HIV-1的新领域。 但是， T20 本身存在着一些缺陷和不足。 首先是耐药性问题： 由于 T20完全衍生 于天然 HR2 序列， 对靶标突变的抵抗力低， 容易产生耐药性。 HR1 第 36-45位残基 ( GIVQQQNNLL, SEQ ID NO: 5 )是 T20结合的主 要部位， 单个残基的突变导致 T20敏感度下降 5 - 10倍， 两个残基突 变则会导致敏感度下降 100倍。 其次， T20体内稳定性差， 易被蛋白 酶降解， 生物利用度低。 再次， T20 具有较高的合成成本。 因此， 在 保证生物活性的前提下如何解决耐药性、 提高酶解稳定性以及降低多 肽类 HIV-1 融合抑制剂的合成成本是新型 HIV-1 融合抑制剂研究的 主要方向。
基于上述问题，目前主要的解决策略是避开 T20的靶标结合部位， 引入不同于 T20的新的功能序列来克服耐药性； 同时， 加入螺旋形成 及稳定因子， 提高序列的螺旋性及稳定性， 提高酶解稳定性及抑制活 性。如第二代多肽类融合抑制剂 T-1249, 在其 N端增加了与 N-trimer 疏水性口袋结合序列 （WQEWEQKI, SEQ ID NO: 6 )， 使其活性比 T20提高了一个数量级； 又如第三代融合抑制剂 T-1144, 和 T20的靶 标作用位点完全不同， 主要为 HR1 的疏水性口袋区 (WEAWERAI, SEQ ID NO: 7),, I期临床研究结果表明， T-1144能够显著抑制 T20 耐药性毒林，同时比 T20显示了更高的活性及更好的药代动力学性质。 此外， 5HR系列多肽开创了基于靶标 gp41 HR1螺旋三聚体的三维晶 体结构应用计算机辅助设计完全非天然 α螺旋肽的新思路。以 5HR为 先导结构，在其 Ν端引入口袋结合区（ WMEWDRE, SEQ ID NO: 8 )， C端引入脂膜结合区 （WASLWNWF, SEQ ID NO: 9 ) ,使得抑制融 合活性得到了显著提高。
Gp41 N-trimer表面的疏水性口袋同时是小分子融合抑制剂的作 用靶点。 如 NB-2, 其 EC5。值达到 1.04 μ Μ; Α12同样在 尔水平显 示了抑制 HIV复制活性， EC5。值为 0.69 μ Μ; 从橄榄叶中提取的天然 小分子化合物羟基酪醇（hydroxytyrosol, HT )抑制 HIV复制活性达 到 50 μ Μ。 但是， 小分子融合抑制剂活性远不及肽类融合抑制剂。 其原 因在于： （1 )单独的小分子只是部分占据了疏水口袋， 与靶标结合力 低， 不足以竟争性抑制 6-ΗΒ形成； （ 2 )单独的小分子识别能力不强， 靶点附近的局部浓度不高。
目前， 尚需要新的有效抑制 HIV的化合物。 发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动， 得到了一类化合物， 并且本发明人惊奇地发现， 该化合物能够有效地抑制 HIV融合。 由此 提供了下述 明： 本发明的一个方面涉及式 I所示的化合物（小分子-多肽缀合物）、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生理毒性的盐，
Sm - Li - A - L2 - Choi 式 I 其中，
Sm为小分子化合物， 例如能够与 HIV-1 gp41 N-trimer表面疏水 性口袋区特异性结合的小分子化合物； 或者 Sm缺失；
为连接多肽 A与 Sm间的连接臂， 例如为使得 Sm能够保持空 间灵活性而与靶标即 HIV-1 gp41 N-trimer表面疏水性口袋区结合的 连接多肽 A与小分子间的连接臂； 或者 缺失；
多肽 A的 ^^^列为 INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL ( SEQ ID NO: 1 )或者 NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL ( SEQ ID NO: 2 ) ；
L2为连接多肽 A与胆固醇分子间的连接臂；
Choi为胆固醇。
根据本发明任一项所述的化合物、 其衍生物、 其立体异构体、 或 其无生理毒性的盐， 其中，
Sm选自如下小分子化合物:
不拘于理论的限制， NB-2-L及 M-A12分别是在 NB-2及 A12分 子的吡咯环 3位引入一个 ^^作为与多肽 A连接的 Linker (连 )； M-NB2及 A12-L分别是在 NB-2及 A12分子的盼羟基上引入羧甲基作 为 Linker (连接臂） ， 使其与多肽 A相连。 上面的小分子化合物均为现有技术中已知的化合物。 ！！！^至 HT8 均为可购买的化合物， HT的合成可以参考实施例 1。
多肽合成也是本领域人员熟知的技术,小分子化合物可以作为最 后的残基与多肽 N端氨基缩合； 缀合物裂解后纯化； C端接有胆固醇 的缀合物需将 C端引入半胱氨酸的中间体纯化后与溴代胆固醇反应， 再次分离纯化。
不拘于理论的限制， 单独的肽类药效团和单独的小分子均显示较 低的融合抑制活性， 本发明人创造性地将衍生于 gp41 HR2的肽类药 效团与非肽类药效团缀合， 特别是在非肽类药效团中选 ^当的位置 引入连接臂， 不破坏原来的活性， 而且使两者发挥协同作用， 设计全 新结构 HIV融合抑制剂， 探索抑制耐药性、 提高肽类药物稳定性及降 低肽合成成本
根据本发明任一项所述的化合物、 其衍生物、 其立体异构体、 或 其无生理毒性的盐，
其中， ^和^独立地选自天然或非天然氨基酸、 二酸、 二胺、 二 醇， 以及一端为氨基或者一端为羧基的聚乙二醇。
根据本发明任一项所述的化合物、 其衍生物、 其立体异构体、 或 其无生理毒性的盐，
其中， ^和^独立地选自：
L型或 D型的： 甘氨酸（Gly) ， 丙氨酸 (Ala), 亮氨酸（Leu) , 异亮氨酸 (He), 谷氨酸（Glu) ,谷酰胺（Gin) ,天冬氨酸（Asp) ， 天冬酰胺（Asn) , 缬氨酸（Val) ,赖氨酸 (Lys), 丝氨酸（Ser) , 苏 氨酸（Thr) ,精氨酸（ Arg) ,组氨酸（His) , 色氨酸（ Trp ) ,苯丙 氨酸（Phe) ,酪氨酸（Tyr) ,半胱氨酸（ Cys )、 甲硫氨酸（Met)；
Y- J ^丁酸（GABA)
6- J ^己酸 (Aca);
乙二酸、 丙二酸、 丁二酸、 戊二酸、 己二酸；
乙二胺、 丙二胺、 丁二胺、 戊二胺、 己二胺； 乙二醇、 丙二醇、 丁二醇、 戊二醇、 己二醇；
NH2-CH2CH2-0-CH2CH2-COOH(PEG1);
NH2-CH2CH2-0-CH2CH2-0-CH2CH2 COOH(PEG2); 和
NH2-CH2CH2-0-CH2CH2-0-CH2CH2-0-CH2CH2-COOH(PEG3)。 根据本发明任一项所述的式 I化合物、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生理毒性的盐， 其中， 所述式 I化合物选自如下的化合物： 1 HT NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
2 HT- β Ala- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
3 HT—Aca— NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
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A12L -INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C 81 A12L- β Ala-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β Ala-C-C
82 A12L--Aca--INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
83 A12L-2Aca--INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
84 A12L -PEd-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
85 A12L--PEG2-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
86 A12L--PEG3-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
87 MA12 NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
88 MA12- β Ala- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL；
89 MA12--Aca-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL；
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91 MA12--PEG!-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
92 MAI2--PEG2-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
93 MAI2--PEG3-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
94 MA12-NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C 95 MA12- β Ala- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
96 MA12--Aca-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
97 MA12-2Aca-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
98 MA12--PEG!--NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
99 MAI2--PEG2--NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β Ala-C-C
100 MAI2--PEG3-NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
101 MA12 INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL；
102 MA12- β Ala- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL；
103 MA12--Aca-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL；
104 MA12-2Aca-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
105 MA12--PEG!-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
106 MAI2--PEG2-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
107 MAI2--PEG3-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
108 MA12-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C 109 MA12- β Ala-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
110 MA12-Aca-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
111 MA12-2Aca-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
112 MAH-PEd-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
113 MAI2-PEG2-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
114 MAI2-PEG3-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
115 NB2L NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL；
116 NB2L - β Ala- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
117 NB2L -Aca-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
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120 NB2L -PEG2- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL; 121 NB2L -PEG3- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
122 NB2L -NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C 123 NB2L- β Ala- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
124 NB2L-Aca-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
125 NB2L-2Aca-NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
126 NB2L-PEG!--NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
127 NB2L-PEG2--NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
128 NB2L-PEG3-NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
129 NB2L INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
130 NB2L - β Ala- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
131 NB2L -Aca-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;
132 NB2L -2Aca- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL；
133 NB2L -PEGi- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL；
134 NB2L -PEG2- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL；
135 NB2L -PEG3- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL；
136 NB2L -INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-C 137 NB2L- β Ala-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
138 NB2L-Aca--INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
139 NB2L-2Aca-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
140 NB2L-PEG!-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β Ala-C-C
141 NB2L-PEG2-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
Ala-C-C 和
142 NB2L-PEG3-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- β
Ala-C-Chol。 本发明的另一方面涉及一种药物组合物， 其含有至少一种本发明 任一项所述的式 I化合物、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生理毒 性的盐； 可选地， 其还包含药学上可接受的载体或辅料； 具体地， 所 述药物组合物为 HIV融合抑制剂。
通常本发明药物组合物含有 0.1 - 90重量％的式 I化合物和 /或其 生理上可接受的盐。 药物组合物可根据本领域已知的方法制备。 用于 此目的时， 如果需要， 可将式 I化合物和 /或立体异构体与一种或多种 固体或液体药物赋形剂和 /或辅剂结合， 制成可作为人用的适当的施用 形式或剂量形式。
本发明的式 I化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给 药， 给药途径可为肠道或非肠道， 如口服、 肌肉、 皮下、 鼻腔、 口腔 粘膜、 皮肤、 腹膜或直肠等。 给药剂型例如片剂、 胶囊、 滴丸、 气雾 剂、 丸剂、 粉剂、 溶液剂、 混悬剂、 乳剂、 颗粒剂、 脂质体、 透皮剂、 口含片、 栓剂、 冻干粉针剂等。 可以是普通制剂、 緩释制剂、 控释制 剂及各种微粒给药系统。 为了将单位给药剂型制成片剂， 可以广泛使 用本领域公知的各种载体。 关于载体的例子是， 例如稀释剂与吸收剂， 如淀粉、 糊精、 硫酸钙、 乳糖、 甘露醇、 蔗糖、 氯化钠、 葡萄糖、 尿 素、 碳酸钙、 白陶土、 微晶纤维素、 硅酸铝等； 湿润剂与粘合剂， 如 水、 甘油、 聚乙二醇、 乙醇、 丙醇、 淀粉浆、 糊精、 糖浆、 蜂蜜、 葡 萄糖溶液、 阿拉伯胶浆、 明胶浆、 羧甲基纤维素钠、 紫胶、 甲基纤维 素、 磷酸钾、 聚乙烯吡咯烷酮等； 崩解剂， 例如干燥淀粉、 海藻酸盐、 琼脂粉、 褐藻淀粉、 碳酸氢钠与枸橼酸、 碳酸钙、 聚氧乙烯、 山梨糖 醇脂肪酸酯、 十二烷基磺酸钠、 甲基纤维素、 乙基纤维素等； 崩解抑 制剂， 例如蔗糖、 三硬脂酸甘油酯、 可可脂、 氢化油等； 吸收促进剂， 例如季铵盐、 十二烷基硫酸钠等； 润滑剂， 例如滑石粉、 二氧化硅、 玉米淀粉、 硬脂酸盐、 硼酸、 液体石蜡、 聚乙二醇等。 还可以将片剂 进一步制成包衣片， 例如糖包衣片、 薄膜包衣片、 肠溶包衣片， 或双 层片和多层片。 为了将给药单元制成丸剂， 可以广泛使用本领域公知 的各种载体。 关于载体的例子是， 例如稀幹剂与吸收剂， 如葡萄糖、 乳糖、 淀粉、 可可脂、 氢化植物油、 聚乙烯吡咯烷酮、 Gelucire、 高岭 土、 滑石粉等； 粘合剂如阿拉伯胶、 黄蓍胶、 明胶、 乙醇、 蜂蜜、 液 糖、 米糊或面糊等； 崩解剂， 如琼脂粉、 干燥淀粉、 海藻酸盐、 十二 烷基磺酸钠、 甲基纤维素、 乙基纤维素等。 为了将给药单元制成栓剂， 可以广泛使用本领域公知的各种载体。 关于载体的例子是， 例如聚乙 二醇、 卵磷脂、 可可脂、 高级醇、 高级醇的酯、 明胶、 半合成甘油酯 等。 为了将给药单元制成胶囊， 将有效成分式 I化合物或其立体异构 体与上述的各种载体混合， 并将由此得到的混合物置于硬的明明胶囊 或软胶囊中。也可将有效成分式 I化合物或其立体异构体制成微囊剂， 混悬于水性介盾中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。 为了将给药单元制成注射用制剂， 如溶液剂、 乳剂、 冻干粉针剂和混 悬剂， 可以使用本领域常用的所有稀幹剂， 例如， 水、 乙醇、 聚乙二 醇、 1,3-丙二醇、 乙氧基化的异硬脂醇、 多氧化的异硬脂醇、 聚氧乙烯 山梨醇脂肪酸酯等。 另外， 为了制备等渗注射液， 可以向注射用制剂 中添加适量的氯化钠、 葡萄糖或甘油， 此外， 还可以添加常规的助溶 剂、 緩冲剂、 pH调节剂等。
此外， 如需要， 也可以向药物制剂中添加着色剂、 防腐剂、 香料、 矫味剂、 甜味 剂或其它材料。
本发明式 I化合物， 或其异构体的给药剂量取决于许多因素， 例 如所要预防或治疗疾病的性盾和严重程度， 患者或动物的性别、年龄、 体重及个体反应， 所用的具体化合物， 给药途径及给药次数等。 上述 剂量可以单一剂量形式或分成几个， 例如二、三或四个剂量形式给药。
本文所用的术语 "组合物" 意指包括包含指定量的各指定成分的 产品，以及直接或间接从指定量的各指定成分的组合产生的任何产品。 可改变本发明药物组合物中各活性成分的实际剂量水平， 以便所 得的活性化合物量能有效针对具体患者、 组合物和给药方式得到所需 的治疗反应。 剂量水平须根据具体化合物的活性、 给药途径、 所治疗 病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。 但是， 本 领域的做法是， 化合物的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水 平开始， 逐渐增加剂量， 直到得到所需的效果。 本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的式 I化合物、 其衍生 物、 其立体异构体、 或其无生理毒性的盐或者本发明的药物组合物在 制备抑制 HIV融合的药物或者试剂例如 HIV融合抑制剂中的用途。
本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的式 I化合物、 其衍生 物、 其立体异构体、 或其无生理毒性的盐或者本发明的药物组合物在 制备用于治疗和 /或预防和 /或辅助治疗 HIV感染相关疾病特别是艾滋 病的药物中的用途。 本发明的再一方面涉及一种在体内或体外抑制 HIV融合的方法， 包括使用有效量的本发明任一项所述的式 I化合物、 其衍生物、 其立 体异构体、 或其无生理毒性的盐或者本发明的药物组合物的步骤。
本发明的再一方面涉及一种治疗和 /或预防和 /或辅助治疗 HIV感 染相关疾病特别是艾滋病的方法，包括使用有效量的本发明任一项所述 的式 I化合物、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生理毒性的盐或者 本发明的药物组合物的步骤。
当用于上述治疗和 /或预防和 /或辅助治疗时， 治疗和 /或预防和 /或 辅助治疗有效量的一种本发明化合物可以以纯形式应用， 或者以药学 可接受的酯或前药形式 (在存在这些形式的情况下)应用。 或者， 所述 化合物可以以含有该目的化合物与一种或多种药物可接受赋形剂的药 物组合物给药。 词语"有效量 "的本发明化合物指以适用于任何医学预 防和 /或治疗和 /或辅助治疗的合理效果 /风险比治疗障碍的足够量的化 合物。 但应认识到， 本发明化合物和组合物的总日用量须由主诊医师 在可靠的医学判断范围内作出决定。 对于任何具体的患者， 具体的治 疗有效剂量水平须根据多种因素而定， 所述因素包括所治疗的障碍和 该障碍的严重程度； 所采用的具体化合物的活性； 所采用的具体组合 物； 患者的年龄、 体重、 一般健康状况、 性别和饮食； 所采用的具体 化合物的给药时间、 给药途径和排泄率； 治疗持续时间； 与所采用的 具体化合物组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。 例如， 本领域的做法是， 化合物的剂量从低于为得到所需治疗效果而 要求的水平开始， 逐渐增加剂量， 直到得到所需的效果。 一般说来， 本发明式 I化合物用于哺乳动物特别是人的剂量可以介于 0.001-1000 mg/kg体重 /天， 例如介于 0.01-100 mg/kg体重 /天， 例如介于 0.01-10 mg/kg体重 /天。
根据本发明的化合物可以有效地预防和 /或治疗和 /或辅助治疗本 发明所述的各种疾病或病症。 本发明中，
所述 "HIV-1 gp41 N-trimer表面疏水性口袋区"由 gp41 NHR 上 的 LLQLTVWGIKQLQARIL ( SEQ ID NO: 10 )残基构成。
所述 "特异性结合" 即小分子可以作用在疏水性口袋中， 显示出 一定的融合抑制活性。 所述小分子是相对于肽而言， 非肽类的药效团 即称为小分子化合物。 附图说明
图 1: 样品配制示意图。 具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述， 但是本领 域技术人员将会理解， 下列实施例仅用于说明本发明， 而不应视为限 定本发明的范围。 实施例中未注明具体条件者， 按照常规条件或制造 商建议的条件进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通 过市购获得的常规产品。
在本发明中使用的缩写具有下面的含义：
AIDS (Acquired Immure Deficiency Syndrome) 艾滋病， 获得性免疫缺陷综合征 Ala (Alanine, A) 丙氨酸
Asn (Asparagine, N) 天冬 Sfe氛
DCM (Dichloromethane) 二氯甲烷
DMF (Ν,Ν-Dimethyl malonate) 二甲基甲酰胺
Env (Envelope glycoprotein) 包膜糖蛋白
ESI-MS(Electronic spray ion mass spectroscopy)电喷雾质讲
Fmoc (Fluorenylmethoxycarbonyl) 甲氧
Gin (Glutamine, Q) 谷酰氨
Glu(Glutamic acid, E) 谷氨酸
6-HB(six-helix bundle) 六螺旋体
HBTU 2-(1Η-1-羟基苯并三唑 )-l，l，3，3-四甲基脲六氡磷酸
His(Histidine, H) 組氨酸
HoBt(l-Hydroxylbenzotriazole anhydrous) 基笨并三氮峻
HR1 ( N-terminal heptad repeat, NHR ) N末端重复序列
HR2 ( C-terminal heptad repeat, CHR ) C末端重复序列
HIV ( Human Immunodeficiency Virus) ) 人免疫缺陷病毒
HIV-1 人免疫缺陷病毒 I型
HPLC(High performance liquid chromatography)高效液相色讲
Ile(Isoleucine, I) 异亮數酸
Leu(Leucine, L) 亮氛酸
Lys(Lysine, K) 赖氨酸
Ser(Serine, S) 丝氛酸
TFA(trifluoroacetic acid) 三氡乙酸
Thr(Threonie, T) 苏氨酸
Tyr(Tyrosine, Y) 路氨酸 实施例所用固相合成载体 Rink酰胺树脂为天津南开合成责任有 P艮公司产品； HBTU、 HOBT、 DIEA以及 Fmoc保护的天然 ^酸或 D型的非天然氨基酸为上海吉尔生化公司以及成都诚诺新技术有限责 任公司产品。 N-甲基吡咯烷酮（NMP )为 ACROS公司产品； 三氟乙 酸（TFA ) 为北京博迈杰科技有限公司产品； 3,4-二羟基苯乙酸、 4- J ^水杨酸、 5- J ^水杨酸、 2,5-己二酮、 叔丁醇以及溴代乙酸乙酯为 ALFA公司产品； DMF、 DCM为韩国三星公司产品； 色谱纯乙腈为 Fisher公司产品。 其它试剂如无说明均为国产分析纯产品。 实施例 1: 化合物 1的制备
1.1 HT的制备及其与连接臂的连接
中间体 2的合成：
氮气保护下用 18.5ml甲醇溶解 0.2g ( 1.19mmol )化合物 1， 滴入 浓 H2S04 3滴， 避光回流 2小时。 反应结束后蒸干反应液， 用乙酸乙 酯重新溶解， 并用饱和 NaHC03洗三遍。 水相合并， 用乙酸乙酯萃取 三遍后合并酯相， 用饱和 NaCl溶液洗至中性。 酯相用无水 Na2S04干 燥过夜， 蒸干溶剂得中间体 2。 收率 96%。
中间体 3的合成：
氮气保护下将 0.21g(1.19mmol)中间体 2溶于 15ml无水氯仿中， 加入 2,2-二甲
3/4 J ^丙烷（DMP ) 1.6ml, 樟脑磺酸 0.06g(0.24mmol)。 避光回流 4小时， TLC监测反应 （石油醚： 乙醚 =7: 1 )反应结束后 用饱和 NaHC03洗三遍， 氯仿相用无水 Na2S04干燥过夜， 蒸干溶剂 得粗产物。 柱层析分离纯化（石油醚： 乙醚 =80:1 )得中间体 3， 收率 71%。
中间体 4的合成：
氮气保护下将 2.54g ( 11.43mmol ) 中间体 3溶于 100ml无水四氢 呋喃中， 加入 LiAlH4 0.22g(5.72mmol),避光反应 6小时。 反应结束后 加入用水湿润的乙醚 5ml， 后加入水 0.5ml， 有沉淀生成。 滤出沉淀后 溶液用无水 Na2S04干燥过夜，蒸干溶剂得粗产物。柱层析分离纯化 (石 油醚： 乙醚 =15:1 ) 的中间体 4， 收率 70%。
中间体 5的合成：
将 0.2g ( 1.03mmol ) 中间体 4溶于 5ml二氯甲烷中， 加入三乙胺 0.3ml, DMAP O.Olg, 水浴搅拌。 称取丁二酸酐 0.24g(2.4mmol)用 3ml 二氯甲烷溶解， 呈悬浊液， 油浴回流。 10分钟后将中间体 4的二氯甲 烷溶液用恒压漏斗滴入， 滴完后 10分钟反应完全。 用 10%柠檬酸水 溶液洗有 W目 1遍， 后用饱和 NaCl溶液洗至中性， 用无水 Na2S04 干燥过夜。 蒸干溶剂得粗产物。 柱层析分离纯化（石油醚： 乙酸乙酯 =8:1 ) 的化合物 5， 收率 80%。
1.2 HT与肽缀合物 (化合物 1)的制备
化合物 5即为 HT的衍生物。 它和 HT的区别只在于在 HT的羟 基上引入了一个羧酸的结构。 在化合物 5与肽相连后， 这个被引入的 羧酸只起到一个连接臂的作用。 所以不需要从化合物 5制备 HT。
多肽可以委托商业上的公司合成， 也可以参考如下方法合成。 多肽合成采用标准的 Fmoc固相方法。选用 Rink Amide树脂， 肽 链由 C端向 N端延长。 缩合剂为 HBTU/HOBt/DIEA。 脱保护剂为哌 啶 /DMF溶液。 裂解剂为三氟乙酸（TFA ) ， 粗肽水溶解后冻干保存。 用中压液相色讲法或高压液相色讲法 （HPLC )进行分离纯化， 纯肽 含量 &90%。 基盾辅助激光解析飞行时间质讲 ( MALDI-TOF-MS )确 定肽序列分子量。
利用 CEM微波多肽合成仪合成肽序列，小分子化合物可以作为最 后的残基与多肽 N 端氨基缩合,然后在多肽裂解条件下脱去羟基保护 基,最后得到小分子-多肽缀合物。
合成条件如下：
保护氨基酸或小分子化合物： 0.2M 的 DMF溶液，
活化剂： 0.45M HBTU/HOBt 的 DMF溶液，
活化碱： 2M DIEA 的 NMP溶液，
脱保护剂： 20% v/v哌啶的 DMF溶液，
封闭试剂： 20% v/v 乙酸酐的 DMF溶液。
称取 Rink Amide树脂 0.5g(0.25mmol)置入 CEM微波多肽合成仪 反应器中， 然后将氨基酸， 小分子， 活化剂， 活化碱， 脱保护试剂， 封闭试剂按上述浓度配制好后， 用 CEM微波全自动多肽合成仪进行 合成。 完成后肽树脂用 DMF洗涤 3遍后用无水甲醇收缩， 室温真空 干燥， 得肽树脂 2.05g。
裂解液 (体积百分比)： 三氟乙酸： 乙二硫醇： 间甲盼： 水 = 82.5 ： 10 ： 5 ： 2.5。
肽树脂（连接小分子 HT )的裂解： 称取微波合成仪合成好的肽树 脂 2.05g， 放入 250ml茄形瓶中， 水浴， 电磁搅拌。 按 1克肽树脂加入 10ml的量配制裂解液。 TFA需预先水浴降温 30min或者预先存放于 水箱中使用； 将配制好的裂解液加入到水浴条件下的肽树脂中， 电磁 搅拌， 树脂变橙红色， 水浴条件下反应 30min, 然后， 撤水浴， 室温 再继续搅拌反应 90min, 反应完成。 剧烈搅拌下向反应器中加入冷乙 醚 200ml， 析出白色沉淀， 继续搅拌 30 用 G4的砂芯抽虑漏斗滤 出析出物，用冷乙醚反复洗涤 3遍，晾干。加入双蒸水 50ml， 乙腈 5ml 使固体充分溶解， 抽虑， 滤液冻干得 N端连接小分子的粗肽 1.03g。
所得连接小分子的粗肽用中压或高压色讲进行纯化。色讲柱为 C8 柱， 洗脱剂为乙腈， 水及少量乙酸。 具体操作步骤： 称取粗肽 l.OOg, 加水 20ml， 乙腈 5ml使固体溶解， 离心 10min(3000转 /分钟)， 取上清 液上样。 色讲柱预先用 15%乙腈 /水 /0.1%水乙酸溶液 200ml平衡。 上 样后继续用 15%乙腈 /水 /0.1%水乙酸溶液 200ml冲洗， 高效液相检测 洗脱液成分。 根据液相检测结果逐渐升高乙腈含量， 直至所纯化的多 肽缀合物主峰被洗脱出来。 合并洗脱液， 旋转蒸发去除大部分溶剂， 冻干得纯的小分子 -多肽缀合物（化合物 1 )，HPLC检测含量大于 90%。 实施例 2 - 7: 化合物 2 - 7的制备
方法同实施例 1， 只是连接小分子与多肽的连接臂 ( linker )分别 替换为 β -丙氨酸 ( β Ala ) , 6- J ^己酸 ( Aca ) , PEd, PEG2, PEG3 将上述作为连接臂的化合物先分别与多肽连接， 再与小分子连接， 得 到化合物 2 -化合物 7。 实施例 8: 化合物 8的制备
胆固醇溴代乙酸酯（Chol-Br ) 的合成
依次称取溴乙酸 6.95g， 胆固醇 7.73g， EDC*HC1 13.43g, DMAP 122mg加入 500ml茄形瓶中， 加入 DCM 500ml， 水浴下搅拌， 溶液呈 黄色。 30min后撤除水浴， 室温下反应 24h, 溶液呈红褐色。 依次用 饱和 NaHC03、 饱和 NaCl洗涤， 无水 MgS04干燥。 适当浓缩后用硅 胶柱湿法装柱上样纯化。 先用石油醚： 乙酸乙酯 =10: 1作为洗脱剂洗 脱 500ml之后将洗脱剂更换为石油醚： 乙酸乙酯 =9: 1， 洗脱下产物， 蒸除溶剂， 真空干燥后得到白色固体 6.3g， 产率 62%。
首先按实施例 1的方法合成多肽， 然后取纯化后的多肽（&90% ) 20mg溶于 0.3ml DMSO中，分别加入 0.2ml Chol-Br 3.0mg的 THF溶 液， 混合均匀后用滴管加入 DIEA 2滴， 室温反应 3h， 用 C4半制备 反相色谱柱分离纯化， MALDI-TOF-MS确证分子量。 实施例 9 - 15: 化合物 9 - 15的制备
首先按实施例 1的方法合成小分子 HT与多肽缀合物， 然后再按 实施例 8 的方法与胆固醇连接， 得到目标化合物， MALDI-TOF-MS 确证分子量。 实施例 16 - 30: 化合物 16 - 30的制备 分别按实施例 1， 实施例 8和实施例 9的方法合成多肽与小分子 HT缀合物， 只是将多肽序列进行变化。 实施例 31: 化合物 31的制备
1. 小分子化合物 MNB2的合成： 将 NB2苯环羧基用叔丁酯保护， 使其 羟基与溴乙酸乙酯反应， 后经皂化水解酯键为羧基， 以便与连 接臂或多 N端进行反应。 合成路线如下：
中间体 2的合成：
称取 4-硝基水杨酸 0.2g于 50ml茄形瓶中， 加入 DMAP 0.006g, 加入叔丁醇 3ml溶解， 呈悬浊液。 称取 DCC 0.24g， 用 3ml无水 THF 溶解。 用衡压漏斗将上述溶液滴入到茄形瓶中， 回流 4小时。 反应完 全后蒸干溶剂， 用乙酸乙酯重新溶解， 后用饱和 NaHC03洗三遍、 饱 和 NaCl溶液洗三遍， 无水 Na2S04干燥过夜。石油醚： 乙酸乙酯 =20:1 过柱纯化。
中间体 3的合成：
中间体 2用 3ml 2-丁酮溶解， 加入固体 K2C03 0.15g, 加热回流 30分钟。 在上述溶液中加入溴乙酸叔丁酯 0.22g， 继续回流 3小时。 反应完全后加入水 15ml， 用氯仿萃取一遍， 氯仿层用 5%NaOH洗两 遍后用饱和 NaCl溶液洗三遍， 无水 Na2S04干燥过夜。 蒸干后得棕色 油状物。 柱层析分离纯化（石油醚： 乙酸乙酯 =8:1 ) ， 得无色油状物 0.18g,, 收率 80%。
中间体 4的合成：
称取 0.2g中间体 3并溶解于 5ml无水甲醇中。 加入 10% Pd/C 0.02g, 50psi下催化氢化。 反应 1小时后滤去 5% Pd/C, 蒸干溶液得 无色油状物， 直接用于下步反应。 收率 98%。
中间体 5的合成：
称取中间体 4 0.3g， 用 5ml甲苯溶解。 加入 NMM O.lml, 2,5-己 二酮 0.23g， 对甲基苯磺酸 O.Olg, 回流 5小时。 反应完成后放置室温， 减压蒸除溶剂得棕红色油状物。加入乙酸乙酯 15ml溶解产物，并用饱 和 NaCl溶液洗三遍， 无水 Na2S04干燥过夜。 柱层析分离纯化（石油 醚： 乙酸乙酯 =30:1 ) ， 得无色油状物。 产率 70%。
中间体 6的合成：
上述所得油状物用 3ml甲醇溶解， 水浴下滴加 lN NaOH lml。 反 应 15分钟后用 1N盐酸中和。 减压蒸除部分溶剂后再用 1N盐酸调 有白色固体析出， 得化合物 7。 产率 95%。
2. 小分子 MNB2与多肽的连接
按照实施例 1中 1.2的方法合成 MNB2与多肽的缀合物。 实施例 32 - 58: 化合物 32 - 58的制备
分别按照实施例 31，实施例 8以及实施例 9的方法合成化合物 32 - 58， MALDI-TOF-MS确证分子量。 实施例 59: 化合物 59的制备
1. 小分子化合物 A12L的合成：
按如下合成路线合成羧基保护的 A12，并使其盼羟基成醚， 降低修 饰所引起的对电性的影响并利用羧甲基的^^与多肽 N端结合。
中间体 2的合成：
称取 5-硝基水杨酸 0.2g于 50ml茄形瓶中， 加入 DMAP 0.006g, 加入叔丁醇 3ml溶解， 呈悬浊液。 称取 DCC 0.24g， 用 3ml无水 THF 溶解。 用衡压漏斗将上述溶液滴入到茄形瓶中， 回流 2小时。 反应完 全后蒸干溶剂， 用乙酸乙酯重新溶解， 后用饱和 NaHC03洗三遍、 饱 和 NaCl溶液洗三遍， 无水 Na2S04干燥过夜。石油醚： 乙酸乙酯 =20:1 过柱纯化。
中间体 3的合成：
中间体 2用 3ml 2-丁酮溶解， 加入固体 K2C03 0.15g, 加热回流 30分钟。 在上述溶液中加入溴乙酸叔丁酯 0.22g， 继续回流 3小时。 反应完全后加入水 15ml， 用氯仿萃取一遍， 氯仿层用 5%NaOH洗两 遍后用饱和 NaCl溶液洗三遍， 无水 Na2S04干燥过夜。 蒸干后得棕色 油状物。 柱层析分离纯化（石油醚： 乙酸乙酯 =8:1 ) ， 得无色油状物 0.18g,, 收率 80%。
中间体 4的合成：
称取 0.2g中间体 3并溶解于 5ml无水甲醇中。 加入 10% Pd/C 0.02g, 50psi下催化氢化。 反应 1小时后滤去 5% Pd/C, 蒸干溶液得 无色油状物， 直接用于下步反应。 收率 98%。 中间体 5的合成：
称取中间体 4 0.3g， 用 5ml甲苯溶解。 加入 NMM O.lml, 2,5-己 二酮 0.23g， 对甲基苯磺酸 O.Olg, 回流 5小时。 反应完成后放置室温， 减压蒸除溶剂得棕红色油状物。加入乙酸乙酯 15ml溶解产物，并用饱 和 NaCl溶液洗三遍， 无水 Na2S04干燥过夜。 柱层析分离纯化（石油 醚： 乙酸乙酯 =30:1 ) ， 得无色油状物。 产率 70%。
中间体 6的合成：
上述所得油状物用 3ml甲醇溶解， 水浴下滴加 lN NaOH lml。 反 应 15分钟后用 1N盐酸中和。 减压蒸除部分溶剂后再用 1N盐酸调 有白色固体析出， 得化合物 7。 产率 95%。
2. 小分子化合物 A12L与多肽缀合物的制备
按照实施例 1中 1.2的方法合成 A12L与多肽的缀合物。 实施例 60 - 86: 化合物 60 - 86的制备
分别按照实施例 59，实施例 8以及实施例 9的方法合成化合物 60 - 86, MALDI-TOF-MS确证分子量。 实施例 87: 化合物 87的制备
1.小分子化合物 MA12的合成：
按如下合成路线合成用苄酯保护苯环羧基， 并在其吡咯环的 3位 引入 以便与肽链相连的小分子化合物 MA12。
中间体 2的合成：
在茄瓶中加入乙酰乙酸叔丁酯（ 5.0ml， 0.03mol )，无水乙醇 25ml， 水浴冷却到 0?。 滴入乙醇钠 （12.3ml， 0.03mol )保持水浴条件反应 15 分钟。 将上述混合液加入到搅拌的化合物 6 ( 2.2ml, 0.03mol ) 的 无水乙醇 /甲苯 [30ml， V (无水乙醇)： V (甲苯 )=2:1]溶液中， 室温搅拌 4 小时。 加入 2N HC1酸化至中性， 蒸除乙醇后加入 EtOAc,有机相水 洗三次， 无水 MgS04干燥。 化合物 7的粗品经硅胶柱层析纯化 [V (石 油醚)： V (乙酸乙酯) =7: 2]得 3.79g浅黄色液体。 收率 57.80%。
中间体 4的合成：
在茄瓶中加入 5- J ^水杨酸（1.80g， 6.44mmol ) ， 用 30ml甲苯 溶解。 加入 N-甲基吗啉（0.71ml， 6.44mmol ) ， 化合物 2 ( 1.52g, 6.44mmol )及对甲苯磺酸 0.08g。 加热回流反应 3小时后冷却至室温。 减压蒸除溶剂后加入乙酸乙酯溶解， 有; W目水洗 3 次， 无水 MgS04 干燥。化合物 4的粗品经硅胶柱层析纯化 [V (石油醚)： V (乙酸乙酯) =9: 1]得 1.02g浅黄色液体。 收率 65.12%。
中间体 5的合成：
化合物 4 (lO.Og, 0.04mol)用 30ml CH2C12及 5ml DMF溶解， 溶解 后加入苄醇（12.85g, 0.12mol ) ,DCC ( 9.0g, 0.04mol )及 4-吡咯烷基 吡啶 1.0g， 室温搅拌 12小时， TLC监测反应进程。 反应完成后蒸除 溶剂， 加入乙酸乙酯 200ml反应物， 滤除 DCU。 有机相依次用饱和 NaHC03, 5%柠檬酸， H20洗涤， 无水 MgS04干燥。 化合物 5的粗品 经硅胶柱层析纯化 [V (石油醚)： V (乙酸乙酯) =7: 2]得 5.8g无色油状物， 收率 42.12%。
中间体 6的合成：
中间体 5中加入 6N HCl/EtOAc溶液， 室温搅拌至原料点消失， 蒸除溶剂后加入石油醚， 置于水箱中，得浅褐色粉末 1.3g。 收率 83%。
2. 小分子 MA12与多肽缀合物的制备
按照实施例 1中 1.2的方法合成 MA12与多肽的缀合物。 实施例 88 - 114: 化合物 88 - 114的制备
分别按照实施例 87，实施例 8以及实施例 9的方法合成化合物 88 - 114， MALDI-TOF-MS确证分子量。 实施例 115: 化合物 115的制备
1. NB2 的保护与连接臂的引入：将 NB2苯环 用苄酯保护， 然后在其吡咯环的 3位引入一个羧基， 以便与连接臂或多肽 N端进行 反应。 合成路线如下：
中间体的 2合成：
化合物 1 (lO.Og, 0.04mol)用 30ml CH2C12及 5ml DMF溶解， 溶解 后加入苄醇（12.85g, 0.12mol ) ,DCC ( 9.0g, 0.04mol )及 4-吡咯烷基 吡啶 1.0g， 室温搅拌 12小时， TLC监测反应进程。 反应完成后蒸除 溶剂， 加入乙酸乙酯 200ml反应物， 滤除 DCU。 有机相依次用饱和 NaHC03, 5%柠檬酸， H20洗涤， 无水 MgS04干燥。 化合物 2的粗品 经硅胶柱层析纯化 [V (石油醚)： V (乙酸乙酯) =7: 2]得 6.2g无色油状物， 收率 45.76%。
中间体 3的合成：
在化合物 2 ( 6.2g, 0.02mol ) 中加入 4N HCl/EtOAc溶液， 室温搅 拌 1小时， 蒸干反应液得化合物 2 (白色固体） ， 直接用于下步反应。
中间体 6的合成：
在三口瓶中加入丙酮 （508ml, 6.90mol ) ， H20 1000ml, KC103 ( 120g, l.lOmol ) 。 机械搅拌下滴入 Br2 ( 206ml, 4.00mol ) ， 约 1.5 小时滴完。 继续搅拌至反应液无色， KC103完全溶解， 反应完成。 萃 取分离，有;^目中加入 MgO振摇， 水洗 3次后用无水 CaCl2干燥。 减 压蒸嬸， 收集沸点为 50-51?镏分， 得无色刺激性液体 140.9g。 收率 14.93%。
中间体 7的合成：
在茄瓶中加入乙酰乙酸叔丁酯（ 5.0ml， 0.03mol )，无水乙醇 25ml， 水浴冷却到 0?。 滴入乙醇钠 （12.3ml， 0.03mol )保持水浴条件反应 15 分钟。 将上述混合 3/4
入到搅拌的化合物 6 ( 2.2ml, 0.03mol ) 的 无水乙醇 /甲苯 [30ml， V (无水乙醇)： V (甲苯 )=2:1]溶液中， 室温搅拌 4 小时。 加入 2N HC1酸化至中性， 蒸除乙醇后加入 EtOAc,有机相水 洗三次， 无水 MgS04干燥。 化合物 7的粗品经硅胶柱层析纯化 [V (石 油醚)： V (乙酸乙酯) =7: 2]得 3.79g浅黄色液体。 收率 57.80%。
中间体 8的合成：
在茄瓶中加入化合物 3 ( 1.80g, 6.44mmol ) ， 用 30ml甲苯溶解。 加入 N-甲基吗淋（0.71ml， 6.44mmol ) , 化合物 7 ( 1.52g， 6.44mmol ) 及对甲苯磺酸 0.08g。加热回流反应 3小时后冷却至室温。 减压蒸除溶 剂后加入乙酸乙酯溶解， 有机相水洗 3次， 无水 MgS04干燥。 化合物 8的粗品经硅胶柱层析纯化 [V (石油醚)： V (乙酸乙酯) =9: 1]得 1.91g浅 黄色液体。 收率 70.48%。
目标化合物 (化合物 9 ) 的合成：
将中间体 8中加入 6N HCl/EtOAc溶液，室温搅拌至原料点消失， 蒸除溶剂后加入石油醚， 置于水箱中，得浅褐色粉末 1.3g。 收率 83%。 115.2 小分子化合物 NB2L与多肽的连接
按照实施例 1.2的方法合成 NB2L与多肽的缀合物。 实施例 116 - 142: 化合物 116 - 142的制备
分别按照实施例 115， 实施例 8以及实施例 9的方法合成化合物 116 - 142， MALDI-TOF-MS确证分子量。 实施例 143: 化合物抑制 HIV-1 介导的细胞 -细胞融合活性评价 ( ICn )
1. TZM-bl细胞和 HL2/3细胞的复苏 /冻存
将细胞冻存管从液氮中取出， 37?水浴迅速升温， 取出细胞冻存液 ( lml ),加至 15ml离心管，并加入 1ml培养基，离心（ 800rpm， lOmin ), 除去培养基， 重新加入 lml新鲜培养基， 并轻吹使细胞均匀悬浮， 将细 胞悬浮液^转移至含有 15ml培养基的 75cm2培养瓶中， 在 37?、 5%C02下培养。
消化细胞并计
1/2 ， 离心， 弃上清， 加冻存液轻吹使细胞均匀悬浮 ( 100万 /ml )，分装至冻存管（ lml/管 )，分别置于 4? ( 30min )、 -20 ? ( 2h ) 、 -80 ? ( 12h ) 、 -196? ^。
2.传代培养
取出细胞培养瓶， 倒去培养基， 加入 2ml消化液， 轻晃使其在细胞 表面平铺均匀，倒去消化液，重新加入 2ml消化液，铺匀，37?消化 2min， 加入 4ml培养 Jf止消化， 取出所有液体， 离心， 弃上清， 加 4ml培养 基并轻吹使细胞均匀悬浮， 取 ΙΟ μ Ι计数， 取 40-50万细胞置于 75cm2 培养瓶中传代培养。
3. 融合实臉
A. 取 TZM-bl细胞（由美国 NIH AIDS Research and Reference Reagent Program提供 )悬浮液稀释至 50万 /ml, 铺入 96孔细胞培养 板， 50 μ 1/孔， 培养 24h。
B. 配样品： 取待测化合物， 先估计化合物的 IC50值， 以这个估 计的值为基础， 乘以两个 4， 再乘以 6得到待测化合物的配制浓度， 例 如：估计样品的 IC50为 ΙΟηΜ,则样品的配制浓度为 10*4*4*6=960nM, 以此浓度为基础， 在 96孔板上第 (1-10)列依次将待测化合物稀释四倍， 11列和 12列为空白溶剂 （空白溶剂即只^^养基， 不含待测样品， 其 中 11列为阳性对照， 为无样品抑制剂条件下以 1:3浓度混合的 TZM-bl 细胞和 HL2/3细胞； 12列为阴性对照，为单一 TZM-bl细胞的化学发光 信号）； DMSO含量 & 6%。
样品配制说明：每个 96孔样品板（每行 12孔，共 8行； Costar 3799, Corning Incorporation, USA )配制 4个样品， 每个样品重复 1次， 如 图 1所示， 以第一行为例将选定浓度的样品放置第 S1孔， 序列稀释 4 倍（即后一个孔的样品浓度是前一个孔的 1/4 ) ， 按此稀释 10个浓度梯 度。 两个孔作为对照只含有培养基， 其中第 11 孔含有靶细胞和效 应细胞为 100%融合对照（阳性对照）， 第 12孔只含靶细胞为无融合背 景对照（阴性对照） 。
C. 取 HL2/3细胞（由美国 NIH AIDS Research and Reference Reagent Program提供 )悬浮液稀释至 100万 /ml,加入细胞板的 (1-11) (A-H), 50 μ 1/孔， 第 12 X (Α-Η)补加 50 μ 1/孔培养基。
D. 立即取步骤 Β中的 20 μ ?/孔样品加入细胞板， 培养 6h。
E. 去除细胞板中每孔中的培养基（120 μ 1/孔） ， 以 PBS 洗 2 次， 150 μ ?/次。
加入稀幹后的裂解液（ 1 X )， 50 μ 1/孔， 裂解 5 其中稀幹后的 裂解液（I X ) 即将 Luciferase试剂盒（Promega, USA ) 中 （5 x ) 的 裂解液用 ^释， 才艮据用量新鲜配制。
F. 取 20 μ 1/孔细胞裂解液铺在 96孔磷t^Lh。
G. 将融化后的 LA緩冲液 ( Luciferase Assay Buffer, Promega Cooperation, USA )加入 LA底物 ( Luciferase Assay Substrate, Promega Cooperation, USA ) 中混匀， 加 40 μ 1/孔于 96孔磚光板中。
Η. 立即在酶标仪上检测发光。 实验的阴性对照为单一 TZM-bl细 胞的化学发光信号， 用 Min表示； 阳性对照为无样品抑制剂条件下以 1:3浓度混合的 TZM-bl细胞和 HL2/3细胞， 用 Max表示； 测定值为某 一样品在某一浓度下的信号值， 用 X表示； 细胞融合率 = ( X-Min ) / ( Max-Min ) *100%。
按照上述方法， 活性测定结果见下面的表 1。
表 1: 抑制 HIV-1介导的细胞融合活性（ IC50 ) 编 抑制活性 序 列
号 ( IC50 ) μ Μ 1 HT NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 68.052士 25.895 2 HT- β Ala- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 46.357士 5.6275 3 HT~Aca~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 84.043 ± 16.476 4 HT-2Aca~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 47.087士 3.7468 5 HT~PEGi~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 123.05士 67.056 6 HT~PEG2~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 36.476 ±3.5698 7 HT~PEG3~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 56.776士 16.747 8 NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 2.3676 ± 0.0464 9 HT--NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 0.0248 ± 0.0443 10 HT- β Ala- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 0.0075士 0.0014 11 HT~Aca~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 0.0068士 0.0054 12 HT-2Aca~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 0.0062 ± 0.0004 13 HT~PEGi~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 0.0097 ± 0.0042 14 HT~PEG2~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 0.0067士 0.0006 15 HT~PEG3~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 0.0046士 0.0006 16 HT INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 67.083 ± 6.0793 17 HT- β Ala- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 46.077士 8.6405 18 HT~Aca~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 66.055士 14.075 19 HT-2Aca~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 45.065士 33.778 20 HT~PEGi~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 79.068 ± 37.077 21 HT~PEG2~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 67.486 ± 23.098 22 HT~PEG3~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 65.756士 22.046 INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 0.0134士 0.0653 HT-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 0.0128士 0.0063 HT- β Ala- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 0.0095 ± 0.0005 HT~Aca~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 0.0056士 0.0084 HT-2Aca~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 0.0066士 0.0007 HT~PEGi~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0049士 0.0008 Ala-C-Chol
HT~PEG2~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0065士 0.0004 Ala-C-Chol
HT~PEG3~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0056 ± 0.0006 Ala-C-Chol
MNB2 NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 56.063 ± 5.0593 MNB2- β Ala- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 67.047 ± 8.8605 MNB2~Aca~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 86.055士 17.075 MNB2-2Aca~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 47.065士 6.0787 MNB2~PEGi~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 99.068 ± 67.064 MNB2~PEG2~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 26.476 ± 4.0560 MNB2— PEG3~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 31.232士 2.4325 MNB2 NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 0.0098士 0.0563 MNB2- β Ala- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0025 ± 0.0003 Ala-C-Chol
MNB2~Aca~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0089士 0.0564 Ala-C-Chol
MNB2-2Aca~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0038士 0.0002 Ala-C-Chol
MNB2~PEGi~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0076 ± 0.0007 Ala-C-Chol
MNB2~PEG2~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0067士 0.0008 Ala-C-Chol MNB2~PEG3~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0046士 0.0009 Ala-C-Chol
MNB2 INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 34.023 ± 5.0693 MNB2- β Ala- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 45.097士 8.0005 MNB2~Aca~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 67.015 ± 10.005 MNB2-2Aca~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 38.005 ± 6.0707 MNB2~PEGi~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 69.098 ± 36.084 MNB2--PEG2-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 21.456 ± 4.0530 MNB2--PEG3-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 34.056 ± 9.0079 MNB2 INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β Ala-C-Chol 0.0236 ± 0.0693 MNB2- β Ala- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0097 ± 0.0005 Ala-C-Chol
MNB2~Aca~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0154士 0.0054 Ala-C-Chol
MNB2-2Aca~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0075 ± 0.0007 Ala-C-Chol
MNB2--PEG1-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0098士 0.0034 Ala-C-Chol
MNB2--PEG2-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0065 ± 0.0030 Ala-C-Chol
MNB2--PEG3-- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0078士 0.0069 Ala-C-Chol
A12L NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 23.043 ± 5.3293 A12L - β Ala- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 35.093 ± 2.3331 A12L ~Aca~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 25.415 ± 4.0021 A12L -2Aca~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 38.005 ± 6.0707 A12L --PEG1-- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 29.009士 12.331 A12L ~PEG2~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 43.212 ± 4.2231 A12L ~PEG3~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 43.235士 1.2213 A12L NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0236 ± 0.0693 Ala-C-Chol
A12L - β Ala- NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0097 ± 0.0005 Ala-C-Chol
A12L ~Aca~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0154士 0.0054 Ala-C-Chol
A12L -2Aca~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0075 ± 0.0007 Ala-C-Chol
A12L ~PEGi~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0098士 0.0034 Ala-C-Chol
A12L ~PEG2~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0065 ± 0.0030 Ala-C-Chol
A12L ~PEG3~ NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0078士 0.0069 Ala-C-Chol
A12L INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 54.095士 4.754 A12L - β Ala- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 42.655士 7.3568 A12L ~Aca~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 38.9876 ± 2.852 A12L -2Aca~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 17.643士 0.5566 A12L ~PEGi~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 22.678士 0.5014 A12L ~PEG2~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 49.366 ± 8.7893 A12L ~PEG3~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL 67.624 ± 24.036 A12L INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0078士 0.0069 Ala-C-Chol
A12L - β Ala- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0236 ± 0.0693 Ala-C-Chol
A12L ~Aca~ INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0097 ± 0.0005 Ala-C-Chol
A12L -2Aca- INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL - β
0.0154士 0.0054 Ala-C-Chol
0869.0/CTOZN3/X3d S.SS8l/CT0Z OAV
由表 1活性结果可见，所有小分子-多肽缀合物均显示了抑制 HIV-1 细胞融合活性， 其中化合物 8-15、 23-30、 38-44、 52-58、 66- 72、 80— 86、 94— 100、 108— 114、 22— 128、 136— 142抑制 HIV融合 活性达到低的 nM水平， 与阳性对照药 T20 (化合物 144 )和 C34 (化 合物 W3)相当。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述， 本领域技术人 员将会理解。 根据已经公开的所有教导， 可以对那些细节进行各种修 改和替换， 这些改变均在本发明的保护范围之内。 本发明的全部范围 由所附权利要求及其任何等同物给出。
& 2004-. All rights reserved.}
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