CRISPR基因编辑技术是“魔剪”还是“乱箭”？——专访赛业生物科技副总裁欧阳应斌博士
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来源：生物探索
最近，相信很多人都关注到了关于“魔剪”CRISPR引发大规模“意外”脱靶效应的新闻。一篇发表在《自然》子刊Nature Methods上的论文给这一生命科学领域的“大明星”带了不小的负面新闻。
借助全基因组测序，研究人员发现，这一革命性的基因组编辑技术能够引入数百种意想不到的突变到基因组中。。
具体来说，该研究中，科学家们对先前经受过CRISPR基因编辑的小鼠进行了全基因组测序。结果发现，两只接受了基因治疗的小鼠的基因组中存在超过1500个单核苷酸突变以及超过100处更大片段的缺失和插入。需要强调的是，这些DNA突变都没有被计算机算法预测出来。
论文共同作者称，没有使用全基因组测序来寻找脱靶效应的研究人员可能会错过潜在的重要突变。即使是一个单个核苷酸变化也会产生巨大的影响。
这篇论文的发表引发了不小的轰动。那么，究竟这是不是一篇值得“恐慌”的论文？CRISPR技术的应用是否会受到很大的影响？近日，记者采访了赛业生物科技技术副总裁、高级科学家欧阳应斌博士。他说：“目前，CRISPR临床应用的安全性是完全不具备的，我们必须投入巨大的资源去把脱靶的真正原因找出来，并设计出有效对策。”
以下是采访实录：
记者：能否请您先介绍一下这一备受瞩目的基因组编辑技术的由来？
欧阳博士：20年前，日本科学家石野良純在克隆一个目的基因时偶然发现一种特别的重复序列；随后10年，研究人员一直在试图破解这种存在于很多细菌和古细菌的神秘序列，并给它冠以CRISPR这么个古怪的名称。CRISPR的“神秘面纱”直到10年前才开始被逐步揭开。原来它是一种以病毒DNA序列为精准打击对象的“导弹防御系统”。
近几年，以MIT张锋实验室为首的科学家小组把这种进化论产生的生物“武器”用在了各个物种的基因改造上，包括果蝇、斑马鱼、老鼠、猴子等。这一便捷高效的基因组编辑工具成为了生命科学研究中前所未有的“利器”。我们甚至可以利用这把“利器”来纠正人类的基因缺陷。一些致力于利用CRISPR技术治疗疾病的公司很快诞生了。目前，已有多家这类公司在美国上市。
记者：据了解，脱靶效应是CRISPR系统一直存着的问题。为什么此次Nature Methods上的这篇论文会引起这么大的“反应”？
欧阳博士：一直以来，关于CRISPR脱靶效应的文章就层出不穷。一些文章称，应该重视脱靶效应，但也有文章称，其实脱靶效应危害不大，是可控的。此外，张锋博士还提供了预测脱靶效应的免费“神器”。
之所以这篇论文反响会如此大，是因为这次发现的问题彻底颠覆了之前大家对CRISPR脱靶效应的普遍看法。最突出的问题是，之前大家关注的脱靶主要是插入/缺失突变indel（insertion & deletion），而这次发现最多的脱靶却是点突变SNV（single-nucleotide variant）。每只鼠有大约1700个点突变加上100多个indel。更匪夷所思的是，这些SNV和indel发生的位置都不在预测出来的脱靶位点上。
记者：您刚刚也提到，之前有很多关于CRISPR脱靶效应的文章。为什么，只有这篇文章才发现“大量点突变”的问题？
欧阳博士：这个我也感到很不可思议。我的猜测是，大家一直没有往这个方向想，而且之前的测序深度不够，没有找到更可靠的技术发现点突变。研究者的关注点都集中在预测出来的脱靶位点可能发生的indel。这次用的是50X的深度测序，而且关注点没有局限于脱靶位点和indel，而是拓展到全基因组的各种突变，问题就显现出来了。
记者：这篇文章发表后，也有很多人发出质疑声。他们认为，之所以出现如此大规模的脱靶，可能是gRNA的设计有问题。您怎么看？
欧阳博士：gRNA的设计确实直接影响脱靶，但不管这次的gRNA是如何设计的，我们之前的预测“神器”完全失灵了。预测出来的前50个脱靶位点没有一个发生脱靶。我们原来的认识是：脱靶风险是与gRNA和基因组相关位置之间的同源程度成正比的，这一次我们完全没有看到这种关系。这仿佛是要逼我们重新回到原点，重新审视脱靶的机理，原来的认识可能完全是错误的。
记者：这篇文章是在小鼠上用CRISPR技术做基因突变，暴露了其严重的脱靶效应，但即使如此，我们是不是仍然可以通过一些办法来区分我们设计的基因突变与脱靶突变，继续用CRISPR在小鼠上做基因功能研究？
欧阳博士：脱靶突变给小鼠模型带来的最大问题是我们不知道一个模型的表现型是我们设计的定点基因突变造成的还是我们不知道的某一个脱靶突变造成的。原则上来说，有两种传统办法可以帮助解决这个问题：一个是通过与野生鼠交配去除模型鼠中的脱靶突变，只剩下我们设计的基因突变；另一个是针对同一个模型多做几个line的鼠，看它们的表现型是不是一致的，如果一致，那这表现型就比较可能是我们设计的突变造成的。不幸的是，这篇文章的数据告诉我们，这两种传统办法都无法解决CRISPR脱靶突变的问题。
单说这1700个点突变和100多个indel，分布在每条染色体上平均有好几十个。通过与野生鼠交配去除这些突变是很困难的，因为每一代交配发生在每一条染色体上的同源重组平均也就不到一次，即使把这个突变数降低一个数量级，通过几代的交配来去除，仍然是非常困难的。
更要命的是，这篇文章发现，分别在两个line的老鼠上的这大约1700个点突变和100多个indel大部分都是相同的，所以通过多拿到几个line的小鼠并得到相同的表现型来说明该表现型来自我们设计的基因突变而非脱靶突变是难以成立的。因为不同line的脱靶突变很可能也是一样的。当然深度的二代测序可以告诉我们脱靶的“真相”，但太贵、太耗时了，也不能去除脱靶突变。
记者：那用CRISPR做小鼠的基因突变还可行吗？
欧阳博士：与传统的ES细胞基因打靶技术制备基因工程小鼠相比，CRISPR技术的最大优点是快捷和低成本。但如果脱靶的问题不能解决的话，用该方法来制备基因工程小鼠显然远远没有ES基因打靶可靠，尤其是像条件性基因敲除（cKO）这样复杂昂贵的项目，实在不建议用CRISPR，因为不用花多得太多的代价和时间，完全可以用ES打靶这个久经考验的金标准。我们两年前推出的TurboKnockout技术平台，在传统ES基因打靶上引入了两项重大技术革新，进一步压缩了ES打靶的周期和成本，是加大了这个金标准的优势。我们的人工智能设计网站更是简化了方案的设计，我们的技术完全可以弥补CRISPR的不足。
记者：这篇论文似乎是给CRISPR技术泼了盆冷水。您如何看待这一技术在医疗领域的应用前景？
欧阳博士：至少在医疗领域我看不到近期内的应用前景。目前CRISPR临床应用的安全性是完全不具备的，我们必须投入巨大的资源去把脱靶的真正原因找出来，并设计出有效对策。但我相信，这项技术在科研上仍然不失为一个有用的工具。下一步我们必须找出问题，解决问题。
关于欧阳应斌博士
欧阳应斌（Marvin Ouyang）于1997年开始就职于美国Oklahoma医学研究基金会，担任高级科学家，成功发现、纯化并克隆了两种硫蛋白转移酶，成功建成基因敲除小鼠模型。2002年担任美国Thios生物制药公司生物部高级科学家，推动了硫酸转移酶小分子抑制剂及重组抗体制药的研发。从2004年开始担任美国Taconic生物科技公司分子生物学部主管，率领十余位科学家成功开发建成四百余种转基因小鼠及大鼠实验动物及疾病模型。在PNAS、Mol Cell Biol.、J. Biol. Chem.等高水平杂志发表论文10余篇。欧阳博士于2012年加入赛业生物科技（ Cyagen Biosciences）公司，主要负责转基因鼠及基因敲除小鼠平台的管理及优化基因魔剪会跑偏？估值百亿的CRISPR突现信任危机
作为一种刚刚出现五年的基因编辑工具，CRISPR/Cas9被称为继DNA聚合酶链反应（PCR）之后最大的生物技术进步。
凭借其快速和高精确度的特点，科学家可以使用该技术来增加、修改或者删除相应的DNA序列，来完成基因编辑，有针对性的制造转基因作物和科研试剂，通过删除或修复有缺陷的基因，治疗人类遗传性疾病。
乐观的估计认为，这是一个年销售额接近500亿美元的庞大市场。面对这项具有巨大潜在经济利益的技术，谁拥有了它的知识产权，谁就有可能最大化市场收益。
但是，正当麻省理工的张锋与加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna之间的专利世纪大战仍在如火如荼进行的时候，这一技术本身却遭遇质疑。当然这种质疑并不是像针对河北工业大学的韩春雨所提出的基因编辑技术的有效性，而是这把魔剪似乎剪的有点过头了。
根据英国《自然》杂志子刊《自然-方法学 Nature Methods》上最新发表的一篇文章，CRISPR基因编辑技术导致小鼠体内上百种非目标基因突变。
顾名思义，基因编辑技术当然是希望在DNA上的特定位置，把特定的基因添加上或者删除掉，如果在本职工作之外，它还能干其他事情，后果就难以预测了。
这篇论文的联合作者、哥伦比亚大学医学中心的Stephen Tsang将这一问题称为“偏靶突变”，而被他们所发现的这些非目标基因的突变，包括单核苷酸突变和基因组非编码区域的突变，具有非常严重的潜在危害。
通俗的说，CRISPR和Cas9其实是科学家在细菌中发现的两种分子，其中CRISPR被称作“规律间隔成簇短回文重复序列Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeatsequences”，是在一些细菌基因组内存在的、成簇排列的DNA序列，Cas9则是一种酶，可以由单链RNA引导在DNA的特定位置完成剪切工作。
CRISPR/Cas9是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统，也是一种对付攻击者的基因武器。
当人们把细菌数十亿年形成的这种保护机制，作为一种技术开发出来之后，是否会导致非目标基因的改写，之前科学家不是没有想到，但是他们一般是用计算机模拟的方法来进行预测，是否存在这种可能，如果存在的话，是否可以接受。
但是这次这篇新的论文所提出的问题，在于他们所发现的非目标基因突变，之前通过计算机模拟都没有预测到。
Tsang博士和他的研究团队对两只通过CRISPR基因编辑治疗失明的小鼠，做了全基因组测序，并进行了健康程度比对。结果发现CRISPR基因编辑技术在成功修复了小鼠体内导致失明的基因的同时，小鼠体内也出现了超过1500个单核苷酸位点变异（SNVs），以及超过100个大片段序列插入与缺失（InDels）。
这说明CRISPR 基因编辑小鼠体内产生的非目标突变。当然这只是这种技术可能产生副作用的证据，但是其导致的非目标基因突变有可能将远远超出人们的想象。
任何一种新的疗法在出现之前，从科学家到管理当局，不仅需要保证这种疗法足够有效，也要保证这种疗法足够安全，是否存在副作用。
存在副作用，并不意味着宣告这种疗法的失败，但是不知道有什么副作用，用于人体进行试验就要慎之又慎，在此之前，就更不可能拿到上市的通行证。
其实，这也不是第一次发现CRISPR基因编辑技术的副作用。早在2014年，美国弗吉尼亚大学医学院的研究人员在《自然-生物技术》杂志上报告称，他们设计了一种方法检测CRISPR/Cas9基因编辑系统的有效性，却发现了其中意想不到的副作用。
他们发现，这种方法有可能会结合意想不到的位点，导致其中一些位点发生基因突变，这些突变可能对药物疗法的研究与开发，产生严重的后果。
作为一种精准打靶的技术，既要研究打靶，也要研究脱靶，尽量争取不脱靶，即使脱靶也把危害降到最小，也是改进这种重要的基因编辑技术的必经之路。
NIH（美国国立卫生研究院）科学政策副主任Carrie Wolinetz就曾经说，
“尽管在这个领域利用新的基因编辑技术有巨大的潜力改善人类健康，但是它不是没有令人担忧之处。”
这也是NIH对于许多针对CRISPR的基础性研究大力支持，但是对于一些科学家将其用于人体的申请非常谨慎的原因。
不过在大洋彼岸，这似乎并不是一个问题。为此我们还创造了好多个世界第一。
不仅首次使用这种方法对人类胚胎进行基因编辑，也首次对癌症病人进行治疗。
之前我们还写过自闭症猴子的事情，当国外对于灵长类的实验要求愈发苛刻的情况下，我们在制造自闭症猴子上拿下了世界第一，但是究竟他们改变的基因是否跟自闭症有关，其实仍然存在争议。
不知道，这是因为我们针对实验伦理的要求太低，还是我们对于“世界第一”的兴趣太高？
我们唯一知道的是，没有基础研究的推进，这种第一是申请不到专利的。
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CRISPR基因编辑技术是“魔剪”还是“乱箭”？
编辑：张俊
记者：欧阳博士，5月30号Nature Methods上的一篇“Unexpected mutations after CRISPRCCas9 editing in vivo”掀起轩然大波，短短几天，科学界已经是山雨欲来，无人不在谈论这篇文章。CRISPR为什么有这么大威力？您能否先简短介绍一下这项技术的由来？欧阳博士：好的。20年前日本科学家石野良在克隆一个目的基因时偶然发现一种特别的重复序列，随后的10年研究人员一直在试图破解这种存在于很多细菌和古细菌的神秘序列，并冠以CRISPR这么个古怪的名称，直到10年前它的神秘面纱才开始被逐步揭开，原来它是一种以病毒DNA序列为精准打击对象的导弹防御系统。近几年以MIT张峰实验室为首的科学家把这种进化论产生的生物武器用在各个物种的基因改造上并把它发挥到了极致，从果蝇到斑马鱼到老鼠到猴子，我们的工具箱里突然多了一种便捷高效的基因组编辑器，一种生命科学研究前所未有的利器，也让我们的科学家插上了想象的翅膀，我们甚至可以想象利用这把利器来纠正人类的基因缺陷。投资人闻讯赶到，把大笔的钱投给了科学家创办的公司，有的公司甚至成为公众公司，很快老百姓也知道了，把更多的钱投给了他们，幻想着在不远的将来收获巨大的利益。这大概就是为什么CRISPR如此威力巨大。记者：说起CRISPR的脱靶效应，这早已不是什么新闻了，一直以来脱靶似乎也没有那么可怕啊？欧阳博士：你说的不错，从CRISPR出道的第一天，关于它脱靶效应的正反文章就层出不穷，仿佛是一场攻防战，一方说有问题，另一方说问题不大、我有办法。最后的舆论导向仿佛是说CRISPR的脱靶效应在可控范围，而且张博士有预测脱靶效应的免费神器，只要大家遵照张博士的指引就无大碍，大家尽可放心使用。记者：可是与以前任何一次不同，这篇文章似乎造成了恐慌，喊了那么多次狼来了，为什么这次人们才意识到狼真的来了？欧阳博士：你用‘恐慌’一词一点不为过，这篇文章一出，美国纳斯达克上市公司CRISPR Therapeutics的股价就应声下跌，我们公司一天之内收到N个客户电话询问我们对他们CRISPR项目的看法，并寻求预案。因为这次发现的问题彻底颠覆了之前大家对CRISPR脱靶效应的普遍看法。最突出的问题是，之前大家关注的脱靶主要是插入/缺失突变indel（insertion & deletion），而这次发现最多的脱靶却是点突变SNV（single-nucleotide variant），而且每只鼠有大约1700个点突变加上100多个indel。更匪夷所思的是，这些SNV和indel发生的位置都不在预测出来的脱靶位点上。记者：是啊，1700个点突变，这么显而易见的事情，怎么现在才被发现？欧阳博士：这个我也感到很不可思议。我的猜测是，大家一直没有往这个方向想，而且之前的测序深度不够，没有找到更可靠的技术发现点突变,并且研究者的关注点集中在预测出来的脱靶位点可能发生的indel。这次用的是50X的深度测序，而且关注点没有局限于脱靶位点和indel，而是拓展到全基因组的各种突变，问题就显现出来了。记者：脱靶不是可以用MIT张峰博士的公式和他们实验室的网站预测吗？如果gRNA设计得当，不应该有这么多脱靶啊，我听说很多人在质疑gRNA的设计有问题。欧阳博士：gRNA的设计确实直接影响脱靶，但不管这次的gRNA是如何设计的，我们的预测神器完全失灵了，预测出来的前50个脱靶位点没有一个发生脱靶。我们原来的认识是：脱靶风险是与gRNA和基因组相关位置之间的同源程度成正比的，这一次我们完全没有看到这种关系，这仿佛是要逼我们重新回到原点，重新审视脱靶的机理，原来的认识可能完全是错误的。记者：过去短短几年，CRISPR技术席卷了整个生命科学界，甚至进入了医疗领域，这篇文章应该是泼了一盆冷水啊！欧阳博士：确实如此，至少在医疗领域我看不到近期内的应用前景。目前CRISPR临床应用的安全性是完全不具备的，我们必须投入巨大的资源去把脱靶的真正原因找出来，并设计出有效对策。但我相信这项技术在科研上仍然不失为一个有用的工具，下一步我们必须找出问题，解决问题。记者：这篇文章是在小鼠上用CRISPR技术做基因突变，暴露了其严重的脱靶效应，但即使如此，我们是不是仍然可以通过一些办法来区分我们设计的基因突变与脱靶突变，继续用CRISPR在小鼠上做基因功能研究？欧阳博士：脱靶突变给小鼠模型带来的最大问题是我们不知道一个模型的表现型是我们设计的定点基因突变造成的还是我们不知道的某一个脱靶突变造成的。原则上来说，有两种传统办法可以帮助解决这个问题：一个是通过与野生鼠交配去除模型鼠中的脱靶突变，只剩下我们设计的基因突变；另一个是针对同一个模型多做几个line的鼠，看它们的表现型是不是一致的，如果一致，那这表现型就比较可能是我们设计的突变造成的。不幸的是，这篇文章的数据告诉我们这两种传统办法都无法解决CRISPR脱靶突变的问题。单说这1700个点突变和100多个indel，分布在每条染色体上平均有好几十个，通过与野生鼠交配去除这些突变是很困难的，因为每一代交配发生在每一条染色体上的同源重组平均也就不到一次，即使把这个突变数降低一个数量级，通过几代的交配来去除，仍然是非常困难的。更要命的是，这篇文章发现分别在两个line的老鼠上的这大约1700个点突变和100多个indel大部分都是相同的，所以通过多拿到几个line的小鼠并得到相同的表现型来说明该表现型来自我们设计的基因突变而非脱靶突变是难以成立的，因为不同line的脱靶突变很可能也是一样的。当然深度的二代测序可以告诉我们脱靶的真相，但这太贵太耗时了，也不能去除脱靶突变。记者：那用CRISPR做小鼠的基因突变还可行吗？欧阳博士：与传统的ES细胞基因打靶技术制备基因工程小鼠相比，CRISPR技术的最大优点是快捷和低成本。但如果脱靶的问题不能解决的话，用该方法来制备基因工程小鼠显然远远没有ES基因打靶可靠，尤其是像条件性基因敲除（cKO）这样复杂昂贵的项目，实在不建议用CRISPR，因为不用花多得太多的代价和时间，完全可以用ES打靶这个久经考验的金标准。我们两年前推出的TurboKnockout技术平台，在传统ES基因打靶上引入了两项重大技术革新，进一步压缩了ES打靶的周期和成本，是加大了这个金标准的优势。我们的人工智能设计网站更是简化了方案的设计，我们的技术完全可以弥补CRISPR的不足。记者：非常感谢您再次接受我们的采访。欧阳博士：不客气，我也很荣幸！欧阳应斌博士高级科学家现任赛业生物科技技术副总裁、高级科学家。研究方向：主要负责转基因鼠及基因敲除小鼠平台的管理及优化欧阳应斌（Marvin Ouyang）于1997年开始就职于美国Oklahoma医学研究基金会，担任高级科学家，成功发现、纯化并克隆了两种硫蛋白转移酶，成功建成基因敲除小鼠模型。2002年担任美国Thios生物制药公司生物部高级科学家，推动了硫酸转移酶小分子抑制剂及重组抗体制药的研发。从2004年开始担任美国Taconic生物科技公司分子生物学部主管，率领十余位科学家成功开发建成四百余种转基因小鼠及大鼠实验动物及疾病模型。在PNAS、Mol Cell Biol.、J. Biol. Chem.等高水平杂志发表论文10余篇。欧阳博士于2012年加入赛业生物科技（ Cyagen Biosciences）公司，主要负责转基因鼠及基因敲除小鼠平台的管理及优化。赛业生物科技简介赛业生物科技集团是全球领先的多元化跨国生物科技实体，2006年成立于美国，中国区总部设立在广州，并在苏州设有子公司，北京、上海、武汉、重庆等地均有办事处。目前员工人数达400余名，总规模超22000平方米，业务经营范围涵盖模式动物、细胞生物学、分子生物学、生物信息学等生命科学领域的多个分支学科。作为全球领先的转基因/基因敲除模式动物商业技术平台，赛业模式生物研究中心达10000平米，其中包括5000平米的SPF级动物实验室，配备有IVC和EVC饲养设备超过500套，可养殖SPF级大小鼠近30000笼，动物种群规模超过15万只。每年可构建基因敲除鼠、转基因鼠模型10000例以上，学术引用累计超过1200篇，是目前国际上最主要、最被认可的基因工程模式动物商业服务平台之一。自主开发的全球首款功能强大的在线载体设计工具VectorBuilder，每年可定制载体超30万个，彻底颠覆生物技术领域传统格局，打造载体构建金标准和新模式。2009年，赛业通过ISO认证并于2012年顺利通过复审，确保向广大专家学者提供的所有产品和技术服务符合国际标准。AAALAC认证的顺利通过，使赛业成为华南地区极少数个获得国际实验动物评估和认可委员会国际认证的单位之一。这不仅是实验动物质量和生物安全水准的象征，更是国际前沿医学研究的质量标志。赛业公司目前在美国加州Santa Clara建立起活体实验鼠检测、隔离中心，成为国内唯一一家具有活体实验鼠类出口能力的生物企业；通过国家出入境检验检疫部门的考核，成为华南地区第一家生物材料出入境绿色通道试点单位，加速了实验动物出入境审批流程，并进一步提升了赛业模式动物中心国际服务的能力。目前公司的产品和技术服务已为全球数百个顶尖生命科学实验室和跨国制药公司提供了帮助，秉承着“为生物科技创造无限可能”的企业愿景服务于全世界的科研学者！更多精彩 >>>摘要：最近，相信很多人都关注到了关于“魔剪”CRISPR引发大规模“意外”脱靶效应的新闻。一篇发表在《自然》子刊NatureMethods上的论文给这一生命科学领域的“大明星”带了不小的负面新闻。借助全基因
最近，相信很多人都关注到了关于“魔剪”CRISPR引发大规模“意外”脱靶效应的新闻。一篇发表在《自然》子刊Nature Methods上的论文给这一生命科学领域的“大明星”带了不小的负面新闻。借助全基因组测序，研究人员发现，这一革命性的基因组编辑技术能够引入数百种意想不到的突变到基因组中。探索君也在第一时间对这篇论文进行了报道。具体来说，该研究中，科学家们对先前经受过CRISPR基因编辑的小鼠进行了全基因组测序。结果发现，两只接受了基因治疗的小鼠的基因组中存在超过1500个单核苷酸突变以及超过100处更大片段的缺失和插入。需要强调的是，这些DNA突变都没有被计算机算法预测出来。论文共同作者称，没有使用全基因组测序来寻找脱靶效应的研究人员可能会错过潜在的重要突变。即使是一个单个核苷酸变化也会产生巨大的影响。这篇论文的发表引发了不小的轰动。那么，究竟这是不是一篇值得“恐慌”的论文？CRISPR技术的应用是否会受到很大的影响？近日，记者采访了赛业生物科技技术副总裁、高级科学家欧阳应斌博士。他说：“目前，CRISPR临床应用的安全性是完全不具备的，我们必须投入巨大的资源去把脱靶的真正原因找出来，并设计出有效对策。”以下是采访实录：记者：能否请您先介绍一下这一备受瞩目的基因组编辑技术的由来？欧阳博士：20年前，日本科学家石野良純在克隆一个目的基因时偶然发现一种特别的重复序列；随后10年，研究人员一直在试图破解这种存在于很多细菌和古细菌的神秘序列，并给它冠以CRISPR这么个古怪的名称。CRISPR的“神秘面纱”直到10年前才开始被逐步揭开。原来它是一种以病毒DNA序列为精准打击对象的“导弹防御系统”。近几年，以MIT张锋实验室为首的科学家小组把这种进化论产生的生物“武器”用在了各个物种的基因改造上，包括果蝇、斑马鱼、老鼠、猴子等。这一便捷高效的基因组编辑工具成为了生命科学研究中前所未有的“利器”。我们甚至可以利用这把“利器”来纠正人类的基因缺陷。一些致力于利用CRISPR技术治疗疾病的公司很快诞生了。目前，已有多家这类公司在美国上市。记者：据了解，脱靶效应是CRISPR系统一直存着的问题。为什么此次Nature Methods上的这篇论文会引起这么大的“反应”？欧阳博士：一直以来，关于CRISPR脱靶效应的文章就层出不穷。一些文章称，应该重视脱靶效应，但也有文章称，其实脱靶效应危害不大，是可控的。此外，张锋博士还提供了预测脱靶效应的免费“神器”。之所以这篇论文反响会如此大，是因为这次发现的问题彻底颠覆了之前大家对CRISPR脱靶效应的普遍看法。最突出的问题是，之前大家关注的脱靶主要是插入/缺失突变indel（insertion & deletion），而这次发现最多的脱靶却是点突变SNV（single-nucleotide variant）。每只鼠有大约1700个点突变加上100多个indel。更匪夷所思的是，这些SNV和indel发生的位置都不在预测出来的脱靶位点上。记者：您刚刚也提到，之前有很多关于CRISPR脱靶效应的文章。为什么，只有这篇文章才发现“大量点突变”的问题？欧阳博士：这个我也感到很不可思议。我的猜测是，大家一直没有往这个方向想，而且之前的测序深度不够，没有找到更可靠的技术发现点突变。研究者的关注点都集中在预测出来的脱靶位点可能发生的indel。这次用的是50X的深度测序，而且关注点没有局限于脱靶位点和indel，而是拓展到全基因组的各种突变，问题就显现出来了。记者：这篇文章发表后，也有很多人发出质疑声。他们认为，之所以出现如此大规模的脱靶，可能是gRNA的设计有问题。您怎么看？欧阳博士：gRNA的设计确实直接影响脱靶，但不管这次的gRNA是如何设计的，我们之前的预测“神器”完全失灵了。预测出来的前50个脱靶位点没有一个发生脱靶。我们原来的认识是：脱靶风险是与gRNA和基因组相关位置之间的同源程度成正比的，这一次我们完全没有看到这种关系。这仿佛是要逼我们重新回到原点，重新审视脱靶的机理，原来的认识可能完全是错误的。记者：这篇文章是在小鼠上用CRISPR技术做基因突变，暴露了其严重的脱靶效应，但即使如此，我们是不是仍然可以通过一些办法来区分我们设计的基因突变与脱靶突变，继续用CRISPR在小鼠上做基因功能研究？欧阳博士：脱靶突变给小鼠模型带来的最大问题是我们不知道一个模型的表现型是我们设计的定点基因突变造成的还是我们不知道的某一个脱靶突变造成的。原则上来说，有两种传统办法可以帮助解决这个问题：一个是通过与野生鼠交配去除模型鼠中的脱靶突变，只剩下我们设计的基因突变；另一个是针对同一个模型多做几个line的鼠，看它们的表现型是不是一致的，如果一致，那这表现型就比较可能是我们设计的突变造成的。不幸的是，这篇文章的数据告诉我们，这两种传统办法都无法解决CRISPR脱靶突变的问题。单说这1700个点突变和100多个indel，分布在每条染色体上平均有好几十个。通过与野生鼠交配去除这些突变是很困难的，因为每一代交配发生在每一条染色体上的同源重组平均也就不到一次，即使把这个突变数降低一个数量级，通过几代的交配来去除，仍然是非常困难的。更要命的是，这篇文章发现，分别在两个line的老鼠上的这大约1700个点突变和100多个indel大部分都是相同的，所以通过多拿到几个line的小鼠并得到相同的表现型来说明该表现型来自我们设计的基因突变而非脱靶突变是难以成立的。因为不同line的脱靶突变很可能也是一样的。当然深度的二代测序可以告诉我们脱靶的“真相”，但太贵、太耗时了，也不能去除脱靶突变。记者：那用CRISPR做小鼠的基因突变还可行吗？欧阳博士：与传统的ES细胞基因打靶技术制备基因工程小鼠相比，CRISPR技术的最大优点是快捷和低成本。但如果脱靶的问题不能解决的话，用该方法来制备基因工程小鼠显然远远没有ES基因打靶可靠，尤其是像条件性基因敲除（cKO）这样复杂昂贵的项目，实在不建议用CRISPR，因为不用花多得太多的代价和时间，完全可以用ES打靶这个久经考验的金标准。我们两年前推出的TurboKnockout技术平台，在传统ES基因打靶上引入了两项重大技术革新，进一步压缩了ES打靶的周期和成本，是加大了这个金标准的优势。我们的人工智能设计网站更是简化了方案的设计，我们的技术完全可以弥补CRISPR的不足。记者：这篇论文似乎是给CRISPR技术泼了盆冷水。您如何看待这一技术在医疗领域的应用前景？欧阳博士：至少在医疗领域我看不到近期内的应用前景。目前CRISPR临床应用的安全性是完全不具备的，我们必须投入巨大的资源去把脱靶的真正原因找出来，并设计出有效对策。但我相信，这项技术在科研上仍然不失为一个有用的工具。下一步我们必须找出问题，解决问题。关于欧阳应斌博士欧阳应斌（Marvin Ouyang）于1997年开始就职于美国Oklahoma医学研究基金会，担任高级科学家，成功发现、纯化并克隆了两种硫蛋白转移酶，成功建成基因敲除小鼠模型。2002年担任美国Thios生物制药公司生物部高级科学家，推动了硫酸转移酶小分子抑制剂及重组抗体制药的研发。从2004年开始担任美国Taconic生物科技公司分子生物学部主管，率领十余位科学家成功开发建成四百余种转基因小鼠及大鼠实验动物及疾病模型。在PNAS、Mol Cell Biol.、J. Biol. Chem.等高水平杂志发表论文10余篇。欧阳博士于2012年加入赛业生物科技（ Cyagen Biosciences）公司，主要负责转基因鼠及基因敲除小鼠平台的管理及优化
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