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芝麻饼残油降解菌的选育诱变
摘要：从自然界土壤中采集到一株可降解芝麻饼残油的菌种，经16S rDNA测定其序列后通过GenBank进行比对及聚类分析。结果表明，菌株16S rDNA长度为1 496 bp，聚类分析显示与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的同源性达99%以上，该原始菌株经过以Co60为惟一放射源的辐射
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摘要：从自然界土壤中采集到一株可降解芝麻饼残油的菌种，经16S rDNA测定其序列后通过GenBank进行比对及聚类分析。结果表明，菌株16S rDNA长度为1 496 bp，聚类分析显示与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的同源性达99%以上，该原始菌株经过以Co60为惟一放射源的辐射诱变，获得突变菌，编号为MT-26。经测定，MT-26的酶活力可达725 U/mL，并对其进行传代试验，证明其具有良好的遗传稳定性。
　　关键词：残油降解；放射诱变；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
　　中图分类号：Q939.9 文献标识码：A 文章编号：（8-03
　　DOI：10.ki.issn16.16.016
　　芝麻属脂麻科，在中国是一种常见的经济作物，是香油类生产的原料。由于香油的品相要求，芝麻在取油工艺上通常使用传统的压榨法取油，以保留香油最纯正的味道[1]，然而通过传统压榨法取油后的芝麻饼中往往含有相当可观的残油量[2]。研究表明，芝麻油中的芝麻素是含量最高的木脂素[3]，由降解芝麻油而获得的小分子脂类物质对调节动植物的生理代谢有比较显著的作用[4，5]。本研究试图对芝麻压榨提油后剩余的饼粕中残油加以利用，对其进行降解获得有应用前景的小分子脂类，提高芝麻饼粕的附加值。笔者在自然界中广泛筛选可有效降解芝麻饼残油的菌株，并对其进行诱变和条件优化，为芝麻饼残油降解菌在农业生产中的应用提供理论支持。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　土壤样品于日采集于湖南长沙市芙蓉区东风屠宰厂，将采集土壤压碎，去除石块、植物根茎，混合均匀，装入聚乙烯自封袋中，于泡沫冰盒中运输及保存[5]。
　　初筛培养基：芝麻饼50 g/L，121 ℃灭菌25 min。显色培养基：芝麻油20 g/L，FeSO4 0.1 g/L，葡萄糖10 g/L，（NH4）2SO4 0.1 g/L，MgSO4 0.1 g/L，NaCl 1 g/L，溴甲酚紫0.02 g/L（1.6%溶液），pH自然。LB培养基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂20 g/L。
　　1.2 方法
　　1.2.1 菌株的筛选 1）菌株的初筛及分离纯化：称取适量处理后的土壤，加入90 mL培养基中进行摇瓶处理，置于37 ℃恒温摇床中24 h[6]。发酵液摇匀后取1 mL，加9 mL灭菌水稀释至10-2，后依次稀释至10-6作不同的浓度梯度，并取200 &L加入制备好的LB培养基中涂布均匀，置于37 ℃培养箱中倒置培养，将培养出的细菌用画线法挑选形态不同的菌斑且较大的菌株进行纯化[7]。
　　2）产脂肪酶菌株的确认：由于脂肪酶降解脂肪后的主要产物为小分子脂肪酸（普通小分子脂肪酸pH为4.8～5.3），本试验使用溴甲基紫作为培养基显色剂，判断菌株是否产生脂肪酶。将纯化好的不同形态菌落接入筛选培养基，如在含溴甲酚紫的培养基中出现淡黄色显色圈，而未接种的培养基内溴甲酚紫不变色，即可初步判定该菌株具有产脂肪酶能力[8]。
　　1.2.2 酶活力及生物量的测定 脂肪酶活力测定采用对硝基苯法[9]，酶活为40 ℃下每分钟分解释放出1 &mol对硝基苯酚的酶量，定义为一个活力单位（U）。生物量测定使用平板计数法。
　　1.2.3 菌株的鉴定 挑取单菌落接于1 mL无菌水中，置于100 ℃沸水浴10 min，5 000 r/min离心10 min，取上清液2 &L作为PCR模板，16S rDNA引物5&-AGGCAGCAGTAGG GAATCTT-3&，5&-CGTGGCTTTC
　　TGGTTAGGT-3&扩增产物交由华大基因公司进行测序。将获得的序列提交GenBank进行比对，提取相似度最高的前5条序列使用MEGA5.05进行分析。
　　1.2.4 菌株的诱变 将初筛具有较高酶活的菌株置于含溴甲酚紫的显色LB培养基中，送湖南省辐射中心进行放射量为60Gy的Co60放射诱变，将相同接种量的培养基用1 cm厚的均质铅板隔绝直接放射后进行不同时间梯度的诱变。
　　1.2.5 发酵效果的测定 使用索式抽提法测定芝麻饼发酵前后的粗脂肪含量以测定发酵效果[10]。
　　2 结果与分析
　　2.1 菌株初筛结果
　　对试验初筛获得的128株有显色圈的菌株（图1），经精确测定菌落半径与显色圈半径的比值后，挑选出30株菌株进行酶活力与生物量的测定，结果见表1。由表1可以看出，菌株酶活为68.203～264.321 U/mL，生物量为12&107～98&107 个/mL，进行测定后选择8号菌株，并命名为MT菌进行下一阶段试验。
　　2.2 菌株的诱变
　　运用Co60对出发菌株进行放射诱变处理，由图2可知，诱变4 h的菌株致死率达到80%，处理5 h致死率达到96%，为提高处理量和诱变效率，试验选择5 h作为诱变计量进行反复诱变。诱变筛选30株显色圈较大的菌株进行下一步试验。
　　挑选显色圈较大的30株菌株，在LB培养基上培养24 h，反应条件为温度37 ℃，振荡速度120 r/min，采用对硝基苯酚法对培养物进行测定，获得OD405 nm并计算酶活和生物量，结果见表2。
　　由表2可知，30株菌株的生物量维持为 28.97&107～208.61&107个/mL，酶活力为121.89～725.23 U/mL，其中26号菌株酶活力最高可达到725.23 U/mL，较原始菌株酶活上升263.67%。因此在进一步研究中选用菌株26，并命名为MT-26。
　　将MT-26菌株接种至试管斜面培养基（LB培养基）传代10次，并测定每次传代酶活力（表3），1～10代的脂肪酶活力为718～736 U/mL，酶活力变化为3.84%，小于5%，说明该菌株具有相对稳定的遗传性。　　2.3 测序鉴定
　　将菌株MT-26的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后送至华大基因科技有限公司进行测序。测得MT-26菌株的16S rDNA的序列长度为1 496 bp，其MEGA5.05聚类分析结果见图4。
　　3 小结与讨论
　　近年来随着芝麻油的畅销及芝麻产量的上升，其榨油副产物芝麻饼粕的产量也不断增加，而传统的处理芝麻饼粕的方法普遍用作动物饲料或者植物基肥[11，12]。芝麻饼中富含丰富粗脂肪、粗蛋白等，直接使用效果较差，造成一定的资源浪费[13]。本试验通过筛选获得能够降解芝麻饼粕中残油的菌株，并对其诱变和培养条件进行初步探索，以期提高芝麻油产品的附加值；通过对大量的菌种筛选，从富含油脂的土壤中分离筛选出一株可以降解芝麻饼中粗脂肪的菌株，对出发菌株进行Co60放射诱变，获取了一株可以稳定遗传的产脂肪酶菌株，命名为MT-26，基因比对结果显示该菌株是一种枯草芽孢杆菌。由于芝麻饼既富含碳源、氮源等营养物质，又含有多种无机盐类物质，试验中在进行菌种筛选时仅使用芝麻饼与水作为摇瓶培养基，为特异性改造可降解芝麻饼粕的菌株作准备。本研究获得的诱变菌株MT-26酶活达到725.23 U/mL，较诱变前有明显的提高，对诱变后的菌株进行传代测定，证明其有良好的遗传稳定性。下一步试验将对菌株MT-26进行培养基条件优化及小规模发酵条件的摸索和优化。
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