第B11版：博闻周刊·自然拼贴
不久前，英国首相卡梅伦访问中国，与我们签署的各种协议中，有一项是向我们出口“猪精液”的，那么——
从英国进口“猪精液”为哪般？
这次从英国进口的就是这种约克夏猪的精液
定安黑猪，是定安本地母猪与洋品种杜洛克公猪杂交培育出杂交优势显著的商品肉猪　　□张田勘　　1每年从英国进口4.5亿元“猪精液”　　不久前，英国首相卡梅伦访问中国，与我们签署的协议中，有一项是向中国出口“猪精液”的，仅这笔买卖每年就可为英国带来4500万英镑的收入（约合4.5亿元人民币）。　　在英国人眼中，这些“猪精液”已成为“液体黄金”。不过，在中国人眼里，却有些不解，自己的本土猪有优势，为啥要配洋猪的种？我们不是有适合做回锅肉的成华猪，有肉质好、皮薄骨细的金华猪……有网友甚至称，中国的公猪从此戴上了绿帽子。　　撇开玩笑成分，从买卖的角度来看，如果不是双方互惠互利，生意是做不成的。进口洋猪精液，最大的好处就是通过优良的洋猪品种与优良的中国本土猪品种杂交，培育出优良的商品猪。这种商品猪的优点主要有两条：一、明显缩短生长周期，二、从营养、口感等方面改善猪的品质。　　2人工授精已成为世界繁殖商业猪的主流　　撇开其他方面不说，仅从猪的饲养角度来说，人们最注重的是两点：一是猪的繁殖速度（产猪），其次是猪的快速生长。为了达到快速产猪和获得优良的猪种，世界养猪业在繁殖方式上已发生了巨大变化，即从自然繁殖过渡到人工繁殖。在丹麦，人工授精的猪为90%-95%；在荷兰、挪威和西班牙，人工繁殖的猪为80%以上；在美国、加拿大、墨西哥和巴西的大型农场，人工繁殖的猪也达到75%；在中国，现在这个比例也快达到50%。　　为什么会出现这种变化呢？主要是自然繁殖与人工繁殖在成本、效率和品种控制方面存在着巨大的差异。　　过去，猪的繁殖主要是依赖猪的自然交配，即猪本交，是指发情母猪与公猪的直接和自由交配。猪本交分单次配种、重复配种、双重配种、多次配种等。&&&　　单次配种指在一个发情期内，母猪只与一头公猪交配一次。重复配种指母猪第一次配种后间隔8-12小时与同一公猪再交配一次。双重配种指母猪与同一品种或不同品种的两头公猪间隔10-15分钟各配种一次。多次配种指母猪与同一公猪分别在母猪发情后第12、24、36小时交配3次以上。　　上述几种自然交配方式，均是适应母猪有持续排卵的特点而设置的，其中重复配种和双重配种是为提高受胎率和产仔数。　　但是猪本交无论怎样都远比不上人工授精的效率。1头公猪猪本交1次的精液，采用常温人工授精可配10-20头母猪，采用冷冻方式人工授精则可配40-50头母猪。　　从节约成本的角度看，人工授精的方式也很明显。例如，用于自然配种饲养一头公猪，可以完成20-30头母猪的配种任务，而1头用作人工授精用的种公猪，则可完成300头母猪的配种。　　根据一些大型猪场统计，相比于猪本交，猪场采用人工授精每生产万头商品猪可提高综合经济效益达20万－25万元。　　还有一点是，随着技术的进步，在猪的精液采集、处理、保存、使用等手段也趋于成熟，猪的人工授精受孕率在90%以上，产仔率平均在8-12头，最多可达到17-20头，与猪本交无显著差异。有研究表明，实施人工授精还可提高幼猪成活率和减少疫病传播。　　3进口“猪精液”可获得更多效益　　有人会问，我们为何要从英国进口“猪精液”呢？　　我们先来说说英国猪。英国有悠久的养猪历史，英国猪耳朵直立、四肢结实，屠宰率高（屠宰后去毛去蹄等的净肉率）、瘦肉率高，像英国最著名的猪种约克夏猪（18世纪在英国约克郡培育成功），不仅生长速度快、饲料利用率高、瘦肉率高和肉色好，而且适应性强、产仔多，是目前世界上分布最广的猪品种。　　当然，中国本土猪亦有很多优点，如口感好、营养高等，但与英国和北美的优良猪种相比有一个较大的缺点，就是生长周期长，一般喂养到90-100公斤的出栏体重需1年时间，而英国猪则只需半年。　　目前，中国是世界上最大的养猪国，2012年，中国生猪存栏量47492万头，猪肉产量5335万吨，占全世界一半。虽然如此，但我们仍存在猪肉供不应求的局面，而英国猪的最大特点是生长快、吃得少、产肉多，引进其优良的基因，对缓解中国猪肉供应紧张局面有利。　　约克夏猪成年公猪体重250-300公斤，成年母猪体重230-250公斤，生长到体重90公斤以上就可屠宰，而养殖约克夏猪到100公斤，只需要6个月。约克夏母猪初产产仔数为9.5-10.5头，存活仔数8.5头以上；经产母猪产仔数11-12.5头，存活仔数10.3头以上。　　中国早在上世纪就开始引进约克夏猪并与本土猪杂交，取得了不错效果，特别在缩短生长周期上优势明显。至于约克夏猪的口感，见仁见智，不过，它与中国本土猪杂交后，猪的肉质会混合有约克夏猪和中国本土猪的双重优点。　　至于为何不直接引入种公猪而要引入精液，原因在于直接引入种公猪存在运输成本高，而饲养也需要一笔钱，直接引入精液省心省力省钱，而且精液保存手段目前已经成熟。　　中国从2007年广泛推广猪的人工授精以来，全国生猪人工授精率提高了8%-10%，改良后的商品猪出栏日期提前5-10天，使全国养殖户增收约230亿元。　　从世界范围看，人工授精技术较为先进的国家获得的收益更大。例如，加拿大魁北克省90％左右的食肉猪均采用人工授精方式繁殖，从1983年到2003年，肉猪背膘下降了7毫米，从出生到长成100公斤的宰杀体重的饲养期减少了26天。　　4猪都有哪些类型？　　根据猪的产肉特点和外形特征，目前可将猪大致分为瘦肉型、脂肪型、兼用型三种。　　瘦肉型猪生产瘦肉能力强，能高效利用饲料转化为瘦肉，生长发育快，肥育期短，瘦肉率达55%-65%。猪的外形特点是躯体长，胸腿肉发达，身躯呈流线型。在国外，这类猪又分为鲜肉型和腌肉型，丹麦的长白猪是典型代表。　　脂肪型猪能生产较多的脂肪，瘦肉率仅占35%-45%，膘厚5厘米以上。这种猪成熟早、繁殖力强、耐粗饲、适应性和肉质好，需较多的碳水化合物饲料，对蛋白质饲料需要较少，但饲料转化率较差。猪的外形特点是体躯宽深而稍短，颈部短粗，下颌沉垂而多肉，四肢短，英国的伯克夏猪是典型代表。　　兼用型猪的体形、胴体肥瘦度、饲料转化率等介于瘦肉型猪和脂肪型猪之间，有的偏向于瘦肉型猪，有的偏向于脂肪型猪，其中苏联大白猪为典型代表。　　现在，我们再说一下约克夏猪。目前，世界上利用约克夏猪与其他猪杂交比较理想的组合是：用约克夏猪母（公）与原产于丹麦的长白公（母）交配，取杂一代的母猪与原产于美国的杜洛克公猪杂交出商品猪。　　在利用约克夏猪上，我国则多用其作父本，与我国本土母猪进行二元杂交或三元杂交，这也是我们购买英国猪精液的主要用法。所谓二元杂交是指两种猪杂交，如约克夏猪作父本与本土母猪杂交，生成的猪称为二元猪。猪的三元杂交是指用第三品种的公猪与二元杂交所选留的一代杂交母猪交配，得到二代杂种猪。　　我们这次引进英国猪精液，除了约克夏猪外，还有非常有名的伯克夏猪，这种黑猪可能是英国最古老的猪种，起源于英格兰中南部的伯克郡，有体质结实、沉积脂肪快等优点，属于脂肪型猪。2011年，我国海南省就引进伯克夏猪与海南五指山土猪杂交，培育出珍贵的小型猪种“藻花香猪”。在饲养中，喂以螺旋藻、构树叶、茉莉花、昆虫等高营养价值的绿色饲料。在生长过程中，除注射国家要求的疫苗外，不注射任何抗生素，生产出来的猪肉肉质细致、赖氨酸含量高，无农药和转基因成分残留，肉质达到国际ＡＡ级有机食品标准，加上其细菌残留量极低，可以生吃。　　5引进外国良种猪与保护本土猪种齐抓并举　　在引进外国优良猪种的同时，还要注意保护好本土优良猪种。在这方面，我们有不少失败的教训。　　最近三四十年，随着洋白猪的引进，许多优秀的本土猪种面临消亡，像黑猪、太湖猪、淮猪、姜曲海猪、冬串猪以及闻名遐迩的南京六合山猪，现在已在散养农户中几近绝迹。　　濒于灭绝的，还有我国最适宜做回锅肉的成华猪。该猪产于四川省成都平原的中部，以成都市的金牛、双流和郫县、温江等区、县为中心产区。虽然成华猪是烹制回锅肉的上佳猪种，但由于生长周期长，为利益考虑，很多养殖户选择弃养。虽然成都市专门修建一个成华猪的保种场，但也仅100头左右，已到濒临灭绝的地步。　　保护好本土猪资源，已成为迫在眉睫的事。　　根据《中国猪品种志》和联合国粮农组织（FAO）统计，中国现有48个地方猪种，占全球猪种资源的34%。这些猪种具有繁殖力高、抗逆性强、肉质好、对周围环境高度适应等优点，其中比较有名的是八大猪系。　　一是荣昌猪，是四川省养猪研究所与四川农大在纯种繁育的基础上导入适当比例的外系基因选育而成。其中的瘦肉型品系，饲养到90公斤体重需189.5天，日增重0.6公斤，肉料比为1∶3.39，瘦肉率达55%。　　二是金华猪，产于浙江金华地区，肉质细嫩鲜美，瘦肉率高、皮薄骨细、早熟易肥，成年公猪体重140公斤，成年母猪110公斤。　　三是上海白猪，出产于上海、宝山两县，体型中等，成年公猪体重258公斤，成年母猪体重117公斤，饲养到90公斤需6个月，瘦肉率55%。　　四是黑盆黑猪，为山东胶州市育成的我国较早的瘦肉型猪，比本地猪多1对肋骨。母猪产仔10头以上，饲养到90公斤需6个月。该猪好饲养，抗病力强，肉质鲜美，瘦肉率达53%左右。　　五是新嘉系瘦肉猪，由浙江省农科院畜牧所育成。新嘉系猪环境适应性强，又具瘦肉型猪的优点。母猪一窝产仔可达14头以上，瘦肉率达59.9%，日增重0.5公斤，肉料比为1∶3.19。　　六是陆川猪，产于广西陆川、合浦、玉林等地，早熟易肥，生长发育快，耐粗饲，繁殖力高，成年公猪体重100公斤，成年母猪75公斤，饲养到85公斤需10个月。　　七是乐平猪，产于江西省乐平市，主要优点是生长快，饲料利用率高，骨细脂多。　　八是成华猪。　　6现代“猪精液”保存技术还需不断突破　　联合国粮农组织（FAO）一直强调，农业生物多样性必须得到保护。该组织的“生物多样性保护条约”规定，包括家养动物在内的食品和农业的遗传资源是全球食品安全的生物基础，各个国家都应当建立家畜基因库，构建一个遗传适应性储备库，以应对环境变化（如全球变暖）、疾病、人类营养所需的新物质、变化的市场条件（所有这些均是不可预知的）等所需。　　中国是一个猪资源大国，建立猪的基因库也势在必行，除了能保存成华猪这类中国独特的猪种外，还可以凭借自己的优良猪种与世界各国交换，以达到杂交改良猪肉品种，维护食物安全的目标。　　而人工繁殖和冷冻保存猪的精液，就是保存本土优良猪种的先进技术之一。　　目前，低温保存猪精液技术已有突破。例如，人们发现甘油是一种上佳的精子高效冷冻保护剂，从而让低温保存和长期贮存猪精液成为现实。液氮也是一种能长期保存猪精液的物质。　　但是，猪精子对低温非常敏感，最适宜温度为15℃-20℃，可保存3-5天。温度过高或过低都会加剧精子死亡，运输过程中的颠簸、温度变化、强烈光照也会加快精子死亡。目前，世界上采用冷冻猪精液授精的猪只，仅占全球商品化人工授精的1%左右。　　为了建造更好的猪基因多样性贮存库，需要有两个方面的技术突破，一是对冷冻保护剂和冷冻方法进行细致的筛选与优化，二是探索冷冻对精子损伤的机理。只有在这两方面取得长足进步，我们才可能有效保护像成华猪一样濒临灭绝的猪种，同时也为引进洋猪种提供方便的条件。
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弱酸性环境对猪精液常温保存的影响
【来源/作者】山东大学 --赵晓娟 【更新日期】 16:21:41
第一章 文献综述
改革开放以来，我国养猪业快速从副业生产向商品化过渡，发展速度让人瞩目。近几年来，随着人们消费水平的提高，人们对肉类的质量有了更高的要求。为了适应市场的这种需求，猪场在扩大规模的同时，也加速了猪种的改良工作。这种情况下，猪人工授精技术研究与应用己成为养猪场增产，降低成本获得更大利润的热点之一。经过多年的实践证明，人工授精技术的应用，可以减少种公猪的饲养数量，降低饲养成本；提高母猪受胎率、产仔数，从而提高配种效益；同时还可以防止由于引入新品种造成的各种疾病的交叉传播，从而大大节省人力、物力和财力，提高养猪生产的经济效益。我国广西、广东、上海、江苏、山东、陕西、北京等地有近百万头母猪接受了常温保存精液人工授精，受胎率达到了80%左右[1]。随着猪人工授精技术的广泛应用，精液保存技术越来越受重视。
精液保存技术通过降低或抑制精子的新陈代谢强度从而达到延长精子在体外存活时间的目的。按照保存温度的不同可将精液保存分为3种保存方法，即常温(17℃～25℃)、低温(0℃～5℃)和冷冻(-79℃～-190℃)保存。由于猪精子的生理特点决定了猪精子经过冷冻之后活率低，受胎率差，且冷冻保存操作复杂，在实际生产中存在很多的问题，而低温保存目前的技术也不成熟。因此经过大量实践证明，常温保存最有利于精液保存，且保存条件要求低，操作简单，输精后受胎率高，更适合在养殖场开展生产。因此，人工授精主要采用常温保存精液，用相对较低的精子剂量获得较高的受精率，从而提高遗传资源利用率。
在精液的常温保存中，精液的保存效果受多方面因素的影响，如保存温度、pH、渗透压、稀释倍数以及微生物的繁殖等，其中稀释液不仅能为精子提供代谢所需的能量、pH和渗透压，还可以抑制精液中微生物的繁殖，起到保护精子的作用。因此稀释液的pH环境对精液的常温保存有很大影响。
1.1 猪精液常温保存概述
1.1.1 猪精液常温保存概况
自1932年猪常温人工授精工作首获成功后，直到1975年，这种技术在世界上才被广泛地使用。上世纪80年代，猪常温人工授精技术在世界范围上的应用与普及有了更大规模。目前，全世界一年中人工授精1次的母猪大约是500~1000万头;受胎率为75%~90%[2]。由于各国发展程度不同，输配的猪基本上采取现采现输，或是保存1~2天。因此，常温下猪精液的保存时间的延长和受胎率的提高，己成为国内外学者非常重视关注的热点问题。
常温保存是将精液保存在一定变动幅度的室温下，利用一定范围的酸性环境抑制精子的活动，减少其能量消耗，使精子保持在可逆性的静止状态而不丧失受精能力。猪精液常温保存通常是通过两种基本途径实现：一是降低保存温度，减少精子的运动和代谢，甚至使精子处于休眠状态；二是控制精液的PH值，使精子处于弱酸性环境下，既不危害精子，又能有效的抑制精子的运动，这两种情况下保存精子，一旦环境温度和pH值恢复到正常，精子又将重新恢复其原有的运动和代谢水平，并能保持正常的受精能力。早期的猪人工授精技术，精液稀释的目的是单纯为了增加精液的容量，以便为更多的母猪输精，从而提高了公畜的配种效能。现代猪人工授精技术，精液稀释不仅要增加精液的容量，还能使精液短期甚至较长期的保存起来，继续使用，便于长途运输，亦扩大良种公猪的配种范围。从而大大提高公猪的繁殖力。随着猪人工授精技术的日益发展和提高，人们对影响精液保存效果的诸多因素进行了广泛而深入的研究。
我国猪常温稀释保存精液人工授精始于50年代。1975年以来，全国先后召开了多次猪人工授精专门会议及包括猪在内的家畜人工授精学术讨论会，这对我国猪人工授精的研究工作，起了巨大的推动作用。近年来，猪常温人工授精工作更是迅猛发展，受胎率都达到了80%以上，但国内外猪精液常温保存技术，在受精率和精子活力上，存在一定差异，这主要由于品种，环境，技术，区域等因素造成的。总体上来说，猪精液常温保存4~6天，基本上能达到正常受胎率和产仔水平[3]。
1.1.2猪精液常温保存的意义
我国养猪业己从传统的副业型转变到效益型，专业化的瘦肉产品生产，养猪业是关系国计民生的重要产业，它直接影响到社会稳定、经济发展的全局，发展好猪的生产，增加收入、促进经济发展、维护社会和谐稳定具有特殊重要的意义。猪精液常温保存技术的推广和应用，将预示着，对种猪的培育和商品猪的生产具有重大的社会意义，经济意义。人工授精技术使养猪生产者降低成本，提高效益，由于人工受精技术，优秀种公猪的精液可以加速品种改良的进程，用很短的时间在大范围内实现资源共享，并在更高程度上避免疫病风险。优良遗传资源迅速扩散，导致一个地区乃至全国的猪质量的提高。为了有效开展猪人工受精，猪精液的稀释保存是关键技术。猪精液保存的水平，是提高人工授精技术的首要环节，极大地提高了公畜使用的时间性和地域性，有效地解决了种公畜不足地区的母畜配问题。猪精液常温保存经过70多年发展，在人工受精中己广泛应用，来满足人工授精的需要，在提高种公猪的利用效率，推动猪人工授精技术的发展具有重大意义。.
1.1.3猪精液常温保存的前景
猪精液常温保存具有很大的实用价值。猪精液常温保存技术在生产实践中，可以有效提高公猪的利用率，充分发挥优良公猪的作用，在保护地方优良品种与加快品种改良等方面也极具研究价值。另外在完善猪人工授精配套技术，避免疾病传染，适时配种，有效提高母猪受胎率和增加产仔数等方面具有很好的应用前景。猪精液的常温保存的操作方法很多资料都进行过报道，常温保存温度，稀释液配方等方面，各种观点意见均不太一致，希望今后进一步研究。
1.2不同因素对猪精液常温保存的影响
1.2.1猪精液常温保存的稀释
精液采集后应尽快稀释，原精贮存不超过30min。未经品质检查或检查不合格（活力0.7以下）的精液不能稀释。稀释液与精液要求等温稀释，稀释操作时要求精液与稀释液的温差不能超过1℃，并且通过调整稀释液的温度使精液与稀释液的温度尽可能的接近，不能反过来操作。稀释时，将适量的稀释液缓慢加入到精液中，然后轻轻摇动或用消毒玻璃棒搅拌，使两者轻柔混匀。如作高倍稀释时，应先作低倍稀释（1：1～2），待半分钟后在将余下的稀释液沿壁缓慢加入。稀释倍数的确定：要求每个输精剂量含有效精子数30亿以上，输精量为80～100ml确定稀释倍数。稀释后要求静置片刻再作精力活力检查，如果稀释前后活力无太大变化，即可进行分装与保存；如果活力显著下降，不要使用。混合精液和新鲜精液首先按1：1稀释，根据精子密度和混合精液的量记录需加入稀释液的量。再进行分装。精液应在排出空气的密封容器中避光保存，减少精子与氧气接触，抑制精子的代谢，延长精液的保存时间。稀释后的精液置于室1～2h后，放入17℃恒温箱贮存，也可将精液瓶或袋用毛巾包严直接放入17℃恒温箱内。以上操作均为防止环境变化过于突然导致精子休克死亡或活力下降。每隔12h轻轻翻动一次，注意操作力度，防止精子沉淀而引起畸形精子增多甚至部分死亡。
1.2.2pH对常温保存的影响
猪新鲜精液pH为7.2～7.5，低于猪精液pH的环境能降低猪精子的代谢和运动水平，延长精液的存活时间[4]。郭洪杞等研究发现，保持稀释液的pH在5.5～6.5之间，稀释后精液pH就会维持在6.5～7.0之间，这样的pH对延长精液寿命有显著效果[5]。何兰花等研究认为，pH为6.4是猪精液保存最佳值。因此，弱酸环境被认为是精液保存的理想环境[6]。但戈新等认为，精液在保存过程中会产生酸性代谢产物，碱性稀释液能中和一部分酸性物质，防止稀释液过酸造成精子死亡[7]。因此，稀释液的pH没有统一的定论。除却稀释液pH对猪精液的影响，在稀释液中添加一定量的缓冲剂可以维持精液pH的动态平衡，同样可以起到保护精子的作用，如柠檬酸钠、磷酸盐类、Tris以及HEPES等。
1.2.3温度对常温保存的影响
精子在体外保存的过程中容易受到外界低温或冷冻的打击，从而出现冷休克现象，造成精子细胞结构破坏，内容物流失，导致精子受精能力下降[8]。在这个过程中，由于温度变化引起精子质膜脂质双分子层的流动性下降，导致精子细胞膜通透性下降或丧失，细胞结构被破坏，内容物流失，膜上和胞内酶活性受到抑制或者失活，甚至导致精子细胞核内DNA的结构发生改变。这一系列的变化首先都是由细胞质膜受到损伤引起的。由于温度的变化使得细胞膜上不同种类的磷脂成分重组，原本包裹在膜磷脂中的蛋白质相互暴露，引起蛋白质间的凝集，造成细胞膜和顶体膜的融合，膜通道的通透性发生改变，细胞内部结构和功能发生根本性的变化。
精子细胞受冷休克影响的程度主要与细胞质膜组成有关。不同的动物精子质膜的组成不同[9]。猪精子质膜由于磷脂酰胆碱含量较低,而磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂含量较高,胆固醇在质膜上分布不对称,而且胆固醇/磷脂比率显著低于其它哺乳动物精子[10]，这就使得猪精子对温度的改变比其他动物更加敏感。
1.2.4渗透压对常温保存的影响
猪精子的渗透压在290～300mosM，可耐受的渗透压为240～380mosM。猪精子的有效存活时间和总存活时间在一定渗透压范围内不会受到很大的影响，但是等渗或稍微高渗的环境比低渗的环境更利于保护精子。通过研究不同渗透压对精子活力的影响，发现250～290mosM对精子活力没有影响，渗透压低于200mosM时能明显降低精子活力。稀释液的渗透压主要由非离子物质维持，如葡萄糖等。稀释液的离子强度对维持稀释液的渗透压没有太大的作用，但离子强度过高会造成精子表面蛋白溶解脱落等损伤。
1.2.5稀释倍数对常温保存的影响精液采集以后按照一定的比例把精液和稀释液混匀，有利扩大精液的容积，并且可以增加受配母猪的数量，提高优秀种公猪的利用率。研究发现，在精液保存过程中精液和稀释液比例的不同对精子活力的影响很大，精液和稀释液的稀释比例越大，精子的活力越低，保存时间越短。考虑到在生产实践中输精所需的精子总量和稀释精液的总体积，人工输精技术准则要求每个输精剂量须含有效精子数30亿以上，输精剂量为80-100mL，并以此来确定确定精液的稀释倍数。
精液由精子和精清组成。在精液稀释时，精清对精子的作用不容忽视。精清中含有抑制精子代谢的物质，较低程度的稀释可以促进精子的运动，较高程度的稀释导致精子丧失运动能力、代谢活性和受精能力下降，这被叫做稀释效应[11]。Watson认为稀释会降低精清里面对精子起保护作用物质的浓度从而损伤精子。为了防止由于精清中保护物质浓度下降而造成的精子损伤，提高精子存活率和顶体完整率，可以在用Beltsville-TS（BTS）高倍稀释的猪精液中添加一定量的精清。精清中含有维持精子运动和存活所必需的各种离子，如K+等，还有维持精子膜稳定和受精能力的蛋白质、抗氧化物质以及其它有益成分，过度的稀释会降低这些成分的浓度，带来大量电解质，造成精子表面电荷过多，产生头对头凝集等有害反应。
1.2.6稀释液配方对常温保存的影响
稀释液的配方一般要满足以下几点要求：1）对精子无害；2）能提供精子营养；3）pH范围适合精子存活；4）渗透压适当；5）原料价廉易得、成分配置简单。根据稀释液配方的要求，人们设计并筛选了大量的配方，并按照保存时间的长短把常温保存稀释粉分为短效（1～3d）、中效（3～5d）和长效（5d以上）3种稀释粉。
一般短效的稀释粉成分简单，适合规模化的猪场自己使用，可以再较短的时间用完，常见的短效稀释粉有BTS、Kive和BL-l。BTS保存3d后的精液，精子活力和顶体完整率均在80％以上，产仔率约为75％[12]；Kive保存1d和3d的精液，分娩率分别为74.5％和64.7％BL-1保存1d和3d的精液，分娩率为65.9％和52.7％。目前市场上出现最多的就是中效的稀释粉，一般可以保存3-5d，这样有利于精液中长距离的运输，且不需要频繁的采集并稀释制作精液，有利于减少畜牧工作人员的工作量；中效的稀释粉种类比较多，国外的有韩国Passion、Prime，比利时Cxm‐zhl，英国的Energy等，国内的有四川精宫、北京浩邦等。韩国Passion保存1d和3d的精液，精子活力分别为0.85±0.04、0.82±0.05，比利时Cxm‐zhl保存1d和3d的精液，精子活力分别为0.85±0.05、0.82±0.06，英国Energy保存1d和3d的精液，精子活力分别为0.84±0.05、0.74±0.03。四川精宫保1d和3d的精液，精子活力分别为0.85±0.06、0.63±0.05。长效的稀释液成分相对复杂，但一般都可以保存精液5d以上，如西班牙Diltec可以保存精液5～10d，日本力之源长效可以保存精液7～14d[13]。
1.2.7常温稀释液的成分
常温精液稀释粉是用于配制适宜猪精子存活、保持其受精力的稀释液[14]。用稀释粉来稀释精液可以扩大精液容积，为精子提供代谢所需的能量物质，提供适当的pH和渗透压环境，并进行缓冲以防止pH的变化，平衡稀释后精液中的电解质，抑制细菌的生长等作用，以保证精子体外存活的时间及结构功能的完整[15]。因此，稀释粉没有统一的成分，但一般都含有营养成分、缓冲液、抗生素和金属离子等。
1.2.7.1营养成份
精子需要产生能量来维持细胞代谢或鞭毛运动，精子主要产能途径是通过糖酵解途径。因此需要在常温保存稀释液中添加营养物质来维持精子细胞的基本代谢。葡萄糖一方面能为精子提供能量，另一方面还可以维持稀释液的渗透压，在绝大多数配方中被使用。对于稀释液中糖的含量来说，糖的浓度不宜过高，否则对精子的顶体有损害作用。周歧生等认为，由于蜜糖中含果糖、蔗糖、葡萄糖等营养成分，并且有抗菌效果，价格低廉，资源丰富，所以，在稀释液中添加蜜糖对精子的保存效果可能优于葡萄糖[16]。
1.2.7.2缓冲剂
在稀释液里面添加缓冲剂能帮助控制精液pH，常用的缓冲剂有碳酸氢钠、柠檬酸钠、Tris、HEPES等缓冲剂。碳酸氢钠、柠檬酸钠能为精子提供一个相对稳定的酸碱环境，中和精子的代谢产物，防止过酸化导致精子死亡[17]。近几年研究发现Tris的缓冲能力更强，对代谢酸中毒和酶反应活动具有良好的缓冲作用，更有利于精子的长期保存。HEPES等两性有机物的缓冲能力比无机物更强，还可鏊合有害金属离子[18]。随着猪常温精液保存技术的进一步发展，人们会研究出更优的缓冲剂来稳定精液的pH，更好的保护精子免受外界环境刺激造成的伤害，使优秀种质资源得到更有效的利用。
1.2.7.3离子浓度
精子在生存过程中需要一些离子的参与。如K+可以维持精子膜上Na+‐K+泵运转，但必须保证细胞内的K+浓度高于细胞外的K+浓度，这样才能产生ATP维持精子的存活和运动，因此在稀释液中添加适当的KCl可防止精子耗竭K+而丧失运动能力。还有一些离子不利于精子保存，如高浓度的Ca2+跨膜流入细胞内会启动精子获能，使精子发生顶体反应，这对完成受精是必需的，但对保存却是有害的。因此，配制稀释液常用去离子水，并加入EDTA等鳌合Ca2+和有害重金属离子。
1.2.7.4精子质膜保护成份
精子质膜对于维持自身的新陈代谢、经历获能、顶体反应、穿透卵母细胞透明带等都至关重要。而精子顶体内含有大量的酶，包括透明质酸酶、顶体蛋白酶和放射冠穿透酶等，这些酶类在精子受精时发挥重要作用，只有顶体完整的猪精子才能与卵膜结合。在体外保存时造成精子顶体或质膜形态学的破坏会对精子受精能力产生不利影响。海藻糖作为一种非渗透性保护剂，能在细胞膜外形成一层保护膜，从而保护细胞膜的完整性，同时海藻糖还具有稳定细胞膜蛋白质的作用[19]。因此，海藻糖在精液的冷冻保存中被大量使用并取得良好的保存效果。除海藻糖之外，其他的一些糖类同样能对精子的膜结构起到一定的保护作用。徐振军等研究认为，蔗糖和乳糖在低温条件下均能对精子的活力和顶体完整率起到较好的保护作用，其中蔗糖的效果要优于乳糖。
1.2.7.6抗菌药物
由于精液在采集和稀释的过程中极易受到外界环境中微生物的污染。而猪的精液富含各种营养物质，极利于微生物的生长繁殖，且在常温保存的环境下，微生物生长繁殖的更快。有研究者认为，若精液被细菌污染，其保存效果会因细菌的种类和数量不同而异，并且指出大肠杆菌等对精液保存影响极大，可在短时间内使精子活力、顶体完整率、pH大幅度下降[20]。因此，在稀释液中加入抗微生物药物，以此来抑制微生物的生长繁殖，延长精液的保存时间，提高受胎率，对猪精液的常温保存有很重要的意义。
青霉素作为稀释液中的抗菌物质，曾经被广泛的应用于常温保存稀释液中，但是由于青霉素对革兰氏阳性细菌的抗菌效果较好，对革兰氏阴性细菌如大肠杆菌等的效果较差。因此，研究者开始研究新的抗菌物质。有试验证明恩诺沙星具有药效稳定、迅速灭菌、无毒等优点，并且它能直接作用于病原体的细胞核，阻断DNA复制的旋转酶，破坏细胞核酸合成，迅速杀灭病原体，对多种革兰氏阳性菌和阴性菌、霉形体、支原体等均有强大的杀灭作用。此外，新一代的抗生素也被应用如：头孢噻呋、阿泊拉霉素等，其抗菌作用还没有总结性的结论。
1.2.7.7抗氧化成份
正常的生命体在呼吸代谢的过程中，都会产生活性氧族（ROS），这些ROS在生命体的生存过程中，既有有利的一面，又有有害的一面。精子在呼吸代谢中产生的ROS在低浓度时能提高精子的活力和受精能力，对精子的保存是有利的；但在高浓度时，ROS主要作用于精子质膜，而精子质膜上含有较多的不饱和脂肪酸，ROS会使精子膜上磷脂发生过氧化反应，损害精子的膜结构，破坏精子的功能；ROS还能破坏精子细胞核中DNA结构，引起精子凋亡；此外，ROS可抑制精子质膜和胞内酶的活性或使酶失活，造成ROS聚集在精子细胞内导致恶性循环，使精子氧化损伤加深而死亡。生物体内一般都含有抗氧化物质，有酶类如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH‐Px）、过氧化氢酶（CAT）等，还有一些维生素、氨基酸和金属蛋白质都可以起到抗氧化作用，如VE、半胱氨酸、转铁蛋白等。但是精子在体外保存的过程中，由于外界环境刺激会产生大量的ROS，使得精子细胞内的氧化平衡遭到破坏。为了对抗高浓度的活性氧族对精子的这种损伤，在稀释液中添加一定浓度的抗氧化物质可以起到保护精子，延长精子存活时间的作用。谷胱甘肽能对抗细胞内的氧化压力，适量添加能有效提高精子的活力和受精能力。而VE作为一种抗氧化剂一方面可以抑制精子质膜上多聚不饱和脂肪酸的氧化，另一方面可以破坏活性氧在脂肪酸侧链和质膜中形成的共价键从而起到抵抗活性氧的作用。
1.2猪精液常温保存的评定
目前常用的评定猪精液常温保存效果的指标有：精子的活率、有效存活时间、生存指数、质膜完整性、顶体完整率和精子的抗氧化能力以及受配母猪的受胎率和产仔数等。其中精子活力的检测方法简单，快速，在生产中得到广泛的应用。尤其是在人工授精中，各养殖场和基层改良站通常只检测活率，但是研究证明，有些活率高的精子由于质膜破裂或顶体损伤不具备受精的能力。因此，在试验研究中检测精子质膜完整性和顶体完整率可以更加系统的分析精子的保存效果。
1.2.1精子活率
精子活率是保证精子通过雌性生殖道并与卵子相遇、穿透卵膜的重要条件，测定的是直线运动精子数占精子总数的比率。因为可以在普通光学显微镜下直接观察计数精子活率，所以这不可避免地带有一定人为误差。尽管精子活率检测有些限制，但猪精子活力与母猪分娩率和产仔率显著相关[21]，人的精子活率与穿卵试验结果的相关系数为0.72，P&0.01[22]，羊的精子活率与穿卵试验结果的相关系数为0.76-0.90，P&0.01[23]。所以精子活率是检测精液质量的一个有效指标，并因为其简单、快捷、廉价，是应用最为广泛的方法，是检测精子质量很好的指标。计算机辅助系统精子分析仪(CASA)的应用，不仅提高了检查结果的客观性，而且提供了许多传统精液分析所不能提供的参数，并且发现与繁殖力显著相关。但是CASA分析系统受诸多因素影响，如精子浓度的准确性，容易受到精液中细胞成份和非细胞颗粒值的干扰，测定值往往偏高。所以，CASA也不能免除其它技术和人为误差[24]。
1.2.2精子顶体完整性
在精子细胞核的前端大约2/3的部分，覆盖着帽状囊泡样的顶体，顶体为一个囊泡状的结构，位于质膜和核膜之间，其中含有与穿卵有关的多种水解酶类。顶体反应是受精过程中重要的一步。发生在活精子中的顶体反应称为真顶体反应(TAR)，这种精子获得了穿透卵子透明带并与卵质膜融合的能力。而当精子死亡时可能失去顶体，这称为假顶体反应(FAR)。顶体反应时，顶体释放出酶，消化卵丘细胞基质，溶解透明带使精子通过质膜，完成受精过程。只有顶体完整的和顶体反应能适时发生的精子才能受精。如果精子的顶体肿胀或脱落，顶体中的酶类丢失，上述的受精过程就不能进行。考马斯亮蓝染色是用来评价精子顶体完整性的一种简单方法，直接染色后就可在光学显微镜下观察[25]。目前，利用免疫荧光技术，即用异硫氰酸荧光素标记的免疫结合物更能准确地检测精子顶体状态。常用的免疫结合物有两类：一类是能深入死精子顶体内与抗原特异结合的CTC；一类是非渗透性的、能与活精子顶体相连物特异结合的植物凝集素。常用的植物凝集素有豌豆豆凝集素、花生凝集素、伴刀豆素，另外还有WGA、RCA-、UEA、LysoTrackerTMGreenDND-26等。尤其是前两种已得到广泛的应用[26]。
1.2.3精子质膜完整性
精子质膜对于维持自身新陈代谢、经历获能、顶体反应（AR）、粘符和穿透卵母细胞透明带至关重要，而质膜又是精子在冷冻解冻过程中最易受到破坏的位点。研究发现，冷冻保存往往造成精子一些获能样变化[27]，而质膜的损伤和变化又会导致其存活力和受精力下降。精子凋亡早期与其他细胞一样，质膜磷脂酰丝氨酸外翻，同时出现染色质凝集和边缘化特征，但仍可保持其通透性。而死精子则完全丧失膜的通透性。所以目前认为精子质膜完整性是其死活的一个间接指标。早在1966年，Drevius和Eriksson曾描述过哺乳动物精子弯尾现象。以后，一些研究表明低渗肿胀实验有助于预测精子对卵子的受精能力，虽然在研究中不同精子参数相关性有差异。肿胀弯尾率与精子获能率、穿卵率和精子活力显著相关。在不同低渗液和不同渗透压下研究表明，猪精子在以柠檬酸与果糖为低渗液（渗透压为150mosm/L,37℃）时尾部肿胀最明显。
1.2.4精子活力
精子活力是指活精子数占总精子数的比率，是一项常规的精液检验。以前人们在应用中把在显微镜下直接观察到的活动的精子当作活精子，它的数值与精子总数比值作为精子的存活率。这种方法由于精子受到温度和稀释液的影响，精子的运动状态不同，所以现在此方法极少使用。目前常规染色方法如伊红染色、伊红一苯胺黑染色、姬姆萨染色等[28]，已广泛应用于动物精子活力的检测中。姬姆萨染色可以着色死精子，以此来计算精子活力但是在常规染色过程中，精子容易受到损伤而死亡，使精子活力于实际情况。随着染色技术的发展，活体荧光染色技术在精子质量检查上得到应用。活体荧光染料对细胞损害很小，因此用该法得到的活力结果是比较准确的。死精子特异性荧光探针有碘化丙锭(PI)、澳化乙锭(EB)、澳乙咤二聚体(EH)和Hoechst33258等；活精子特异性荧光探针有羧基荧光素双醋酸盐(CFDA)、羧基二甲基荧光素双醋酸盐(CDMFDA)、钙黄绿素乙酰基甲基酯(CAM)、Hoechst33342等[29]。
1.2.5中性彗星电泳
完整的精子DNA是繁殖优良后代的必要条件。猪精子DNA稳定性受锌离子影响，它会结合自由巯基在鱼精蛋白之间形成二硫桥结构。精子中高水平的DNA损伤伴随着低受精率，或者与早期胚胎死亡有关。
彗星电泳又被称为单细胞凝胶电泳(SCGE),是一种检测单个哺乳动物细胞DNA损伤的技术，起源1978年Rydberg和Johanson报道的无电泳的单细胞凝胶分析。1988年此技术被进一步发展为在碱性条件下。中性彗星电泳能检测单个细胞DNA链断裂，所以被广泛应用。细胞经裂解及DNA解旋后,在电泳过程中,断裂的DNA碎片因携带负电荷而向正极移动,未断裂的DNA在原位不动,经溴化乙锭染色后,核在原位形成一个明亮的头部，DNA碎片形成尾部,似彗星状,DNA损伤越严重,碎片越多,尾部DNA越多,尾部长度越长。因此,测量彗星尾部形状或荧光强度就可知DNA损伤的程度。
1.3研究目的及意义
本次实验以常温保存的猪精液为材料，通过调节稀释液的pH值，观察pH为6.2至6.7的弱酸性环境对于猪精液活率、顶体完整性及质膜完整性的影响，在理论上探究适宜猪精液常温保存的弱酸性环境，增强猪精子在保存过程中的活力，提高常温保存精液的品质，为猪精液常温保存技术更加广泛地应用提供参考。
第二章 弱酸性环境对猪精液常温保存的影响
目前普遍认为常温保存是将采集的精液保存在具有一定变动范围的室温下，利用一定范围的酸性环境抑制精子的活动，减少其自身的能量消耗，使精子保持在可逆的状态而不丧失其受精能力。Kuster等认为猪新鲜精液pH为7.2～7.5，低于猪精液pH的环境能降低猪精子的代谢和运动水平，延长精液的存活时间[4]。当精液的pH值降低时，精子的代谢和活动力都减弱[30]。在附睾内，精子的生存环境为弱酸性，精子呈休眠状态。因此可利用酸性环境抑制精子的活动。为使精液能在室温环境保存多日，精液可用二氧化碳饱和，或使pH降到6.35，这相当于使精子处于附睾内状态，也和低温抑制其活动相似。保持稀释液的pH在5.5～6.5之间，稀释后精液pH就会维持在6.5～7.0之间，这样的pH对延长精液寿命有显著效果。因此，弱酸环境被认为是精液保存的理想环境。但戈新等认为，精液在保存过程中会产生酸性代谢产物，碱性稀释液能中和一部分酸性物质，防止稀释液过酸造成精子死亡[13]。因此，稀释液的pH没有统一的定论。
本试验中我们将稀释液的pH调节为6.2到6.7共6个不同的梯度，将猪精液稀释后进行常温保存，通过检测不同pH下猪精液的活率、质膜完整性、顶体完整性，探究适宜猪精液常温保存的最佳弱酸性环境。
2.1材料与方法
2.1.1.1试验材料
新鲜公猪精液（采集自武功县山佳生态种猪场健康种猪）
2.1.1.2主要仪器设备
台式冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂，TDL-40B型)；超净工作台(苏州净化)；普通冰箱(SIEMENS)；倒置显微镜(Thermo)；实验室用pH计（上海禹昂）；水浴锅(上海精宏)；电子天平(sartorious)；数显恒温培养箱(Thermo)；超纯水仪(北京艾斯泰克)等。
2.1.1.3实验试剂
(1)BTS稀释液：称取葡萄糖3.70g，柠檬酸钠0.60g，EDTA0.125g，碳酸氢钠0.125g，氯化钾0.075g，青霉素钠0.06g，硫酸链霉素0.10g，加双蒸水至100mL，溶解后过滤待用。
(2)柠檬酸盐精子低渗液：称取二水柠檬酸钠 0.735 g，果糖 1.351 g 加双蒸水至 100mL。
(3)0.01mol/L盐酸溶液
(4)甲醛固定液：取浓甲醛10mL，加入PBS缓冲液（pH7.2） 90ml混匀。
(5)姬姆萨染色液：以1g的姬姆色素染料加入66ml甘油，混匀，60度保温溶解两小时，再加入66ml甲醇混匀，即配成姬姆色素原液，此原液用前用PBS（7.4）稀释十倍左右就可以使用（此为姬姆萨工作液）。
2.1.2.1稀释液的pH调节
取10ml离心管7个，编号为1-7。每个离心管中加入配制好的BTS稀释液2mL，用0.01mol/L盐酸溶液调节BTS稀释液的pH值，使1-6号管的对应pH分别为6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7，7号管不进行调节，作为对照组。完成后保存于冰箱中备用。
2.1.2.2精液的稀释与保存
获取实验用精液后将70mL精液分装为7份，在15℃下，低速离心，800xg离心15min，弃去上清，将1-7号离心管中的BTS稀释液加入，混匀后置于恒温培养箱中，17℃保存。
2.1.2.3精子活率测定
精子活率的测定采用目测法。从17℃恒温箱中取出保存的精液，用移液枪吸取10μL置于载玻片上，盖上盖玻片后立即在400倍光学显微镜下观察。每个样品随机观察5个视野，每次数200个精子，检测直线前进运动的精子数占总精子数的比例，计算精子活率。精子活率=（直线前进运动精子数/精子总数）×100%
2.1.2.4精子质膜完整性测定
从17℃恒温箱中取出保存的精液，用移液枪吸取10μL置于载玻片上，用预热至37℃的柠檬酸盐低渗液混匀孵育30min，盖上盖玻片后在400倍光学显微镜下观察。每个样品随机观察5个视野，每次数200个精子，计算精子质膜完整率。
精子质膜完整率=（弯尾精子数/精子总数）×100%
2.1.2.5精子顶体完整性测定
从17℃恒温箱中取出保存的精液，用移液枪吸取20μL置于载玻片上，制成抹片后在空气中干燥，甲醛固定15min后缓慢的用双蒸水冲洗，干燥后均匀滴加姬姆萨染色液，使其全部覆盖，染色1.5h后缓慢的用双蒸水冲洗，置于空气中干燥，在400倍倒置显微镜下观察，每个样品随机观察5个视野，每次数200个精子，计算精子顶体完整率。
精子顶体完整率=（顶体完整精子数/精子总数）×100%
2.1.2.6统计分析
整个试验进行3次重复，所有试验样品每隔8小时进行一次品质测定，共测定7次，实验数据用SPSS 20.0软件处理，以均值±标准差(Mean±SD)表示。
2.2结果分析
2.2.1精子活率测定结果
用不同pH稀释液稀释后的精液每隔8h进行精子活率测定。测定结果如表1所示。 表1 0-48h中不同弱酸性环境下的精子活率 单位：%
注：同一行不同字母表示差异显著（P&0.05）
精液在刚经过稀释后的活率较大并无显著性差异（P&0.05），说明初始条件相同。24h后观察精子活力明显出现下降,其中用pH为6.4和6.5的稀释液稀释的精液精子活率最高，分别为60.83%和60.50%，且无显著差异（P&0.05）。48h后观察，用pH为6.2、6.3和6.7的稀释液的精子活率已经很低，而pH为6.4的稀释液保存的精子仍有46.67%的活率。72h后观察精子活率都降至0。
2.2.2精子质膜完整性测定
用不同pH稀释液稀释后的精液每隔8小时进行精子质膜完整性测定。测定结果如表2所示。
表2 0-48h中不同弱酸性环境下的精子质膜完整性 单位：%
注：同一行不同字母表示差异显著（P&0.05）
精液在刚经过稀释后的质膜完整性较大并无显著性差异（P&0.05），说明初始条件相同。24h后观察，精子质膜完整性出现明显下降，其中用pH为6.4和6.5的稀释液稀释的精液精子质膜完整率较高，分别为51.33%和56.33%。48h后观察，pH为6.5的稀释液保存的精子质膜完整性是最好的，为42.17%，pH为6.4的稀释液中的精子质膜完整率略低，为35.50%，而pH6.2的稀释液中的精子质膜完整性最差，仅有19.67%。72h后观察精子质膜完整性都降至0。
2.2.3精子顶体完整性测定
用不同pH稀释液稀释后的精液每隔8小时进行精子顶体完整性测定。测定结果如表3所示。
表3 0-48h中不同弱酸性环境下的精子顶体完整性 单位：%
注：同一行不同字母表示差异显著（P&0.05）
精液在刚经过稀释后的顶体完整性较大并无显著性差异（P&0.05），说明初始条件相同。24h后观察精子顶体完整性出现明显下降，其中用pH为6.4和6.5的稀释液稀释的精液精子顶体完整率较高，分别为61.00%和59.00%。48h后，pH为6.2、6.6、6.7的稀释液保存的精子顶体完整率很低，pH为6.4和6.5的稀释液稀释的精液精子顶体完整率仍较高，分别为45.67%和45.50%。72h后观察精子顶体完整性都降至0。
在弱酸环境下精子的代谢和活动受到抑制，能量消耗降低，体外存活时间相应延长。因此，学者普遍认为常温保存猪精液的理想环境是弱酸环境。
Kuster 等认为，若稀释液 pH 保持在5.5～6.5，那么稀释后精液 pH 就在6.5～7.0范围内，这对延长精子的存活时间有显著效果[4]。周歧生和陆增康研究发现精液稀释剂的pH在5.8时较适宜，精子的pH在7.0～7.5之间，弱酸性环境可以降低其代谢率，延长保存时间[16]。何兰花等研究认为，pH为6.4是猪精液保存最佳值[6]。霍立军等研究发现，稀释液中较高浓度的葡萄糖可以使猪精液的pH保持在6.0以下[31]。但是精子在保存过程中，会产生酸性的代谢产物，如糖酵解产生的乳酸，还有过氧化所产生的过氧化氢等，这些物质会使精液的pH更低，导致精子酸中毒，损害精子的质膜和顶体，破坏精子的结构。尤其是暴露在空气中的精液由于氧气的进入更加强了精子的代谢。
在调节稀释液pH的同时，在稀释液中添加一定量的缓冲剂可以维持精液pH的稳定，防止由于精液环境变化导致的精子损伤。常用的缓冲剂有柠檬酸钠、磷酸盐类、Tris以及HEPES和MOPS等两性有机缓冲剂[15]。柠檬酸钠和磷酸盐类是常用的缓冲剂，Tris的缓冲能力更强，同时该物质对代谢酸中毒具有良好的缓冲作用，另外，HEPES和MOPS等两性有机缓冲剂的缓冲能力比无机的缓冲剂要强，并且这类缓冲剂还具有鳌合有害金属离子的作用。本试验通过检测不同pH的弱酸性环境下保存的常温猪精液活率、质膜完整性和顶体完整性，研究弱酸性环境对猪精液品质的影响。研究发现，24h后不同pH的稀释液保存的精液活率、质膜完整性和顶体完整性出现明显的下降。pH为6.4的稀释液的精子活率较高，17℃下保存48h后为46.67%，pH为6.5的稀释液的精子质膜完整性较高，17℃下保存48h后为42.17%，而pH6.4和6.5环境下的精子顶体完整性均较高，保存48h后分别为45.67%和45.50%。这一结果与何兰花等人的研究结果较为一致。这是由于pH为6.4和6.5的弱酸性环境使精子处于附睾内状态，精子的代谢和活动力均减弱而延长了存活时间，导致稀释液的保存效果较好。而pH值为6.2的稀释液保存的效果较差，48h后的精子活率、质膜完整性和顶体完整性分别为13.33%、19.67%和18.00%。这是由于pH过低的弱酸性环境造成精子酸中毒，损害了精子的质膜和顶体结构，导致精子死亡。而在pH6.4到6.5之间更精确的适宜精子保存的弱酸性环境仍有待于进一步的试验和研究。
不同pH的弱酸性环境对猪精液的常温保存效果有较大影响。pH为6.4和6.5的稀释液常温保存猪精液的效果较好。
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【关键词】猪精液,常温保存,弱酸性环境,奥科官网&
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